¿Cuáles son los pasos y precauciones clave en el proceso de extracción de ARN?
Hay tres tipos principales de ARN en las células: el ARNr representa aproximadamente el 80%-85%, el ARNt y el ARN nuclear pequeño representan aproximadamente el 10%-15%, y el ARNm representa aproximadamente el 1%-5%. % Representa la gran mayoría, por lo que lo que podemos ver con la electroforesis en gel de agarosa es ARNr, que también tiene tres tipos: 28S, 18S y 5S. Entonces lo que vemos también debería ser tres bandas, y el brillo de 28S es. 18S Dos veces. Solo se puede utilizar dicho ARN para construir una biblioteca.
Al extraer ARN, asegúrese de prestar atención a la contaminación por ARNasa, ya que la ARNasa degrada fácilmente el ARN, por lo que debe hablar lo menos posible durante el proceso. operación y operar en un ambiente limpio, principalmente para evitar la contaminación de RNasa en las manos, la saliva y el aire, por otro lado, todos los instrumentos de vidrio, pipetas, puntas de pipeta y tubos de centrífuga utilizados se tratan con una solución de DEPC al 0,5% durante la noche y luego. esterilizado en autoclave Esterilice durante 15 minutos. Sin embargo, los productos de plástico esterilizados de un solo uso están básicamente libres de RNasa y pueden usarse directamente para extraer ARN sin tratamiento. Los productos de vidrio y plástico comunes que se usan en los laboratorios a menudo están contaminados con RNasa y deben estar a 180 grados. antes de su uso, hornee en seco durante 8 horas o más (cristalería) o enjuague con cloroformo (productos de plástico). Además, debido a los diferentes materiales, el azúcar y las sustancias fenólicas contenidas en el cuerpo son diferentes, por lo que los métodos utilizados para diferentes materiales deben ser diferentes. también ser diferente.
Los siguientes son dos métodos de extracción. El primero es adecuado para la extracción de ARN total de tejidos tiernos o tejidos animales, y el segundo es adecuado para la extracción de tejidos viejos.
>Reactivos: Tampón de extracción, KAc (5M), alcohol isopropílico, etanol absoluto, agua DEPC
Instrumentos: centrífuga, baño María a temperatura constante, mortero
Método 1 Animales, plantas (aislamiento tierno de ARN total de hojas)
Se trituraron unos 2 gramos de tejido vegetal o animal con nitrógeno líquido
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Añadir 5ml de Trizol lisis solución
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12000rpm, 4 grados, 10 minutos
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Añadir 1ml de cloroformo
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Agitar violentamente durante 15 segundos e incubar a temperatura ambiente durante 2-3 minutos
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Centrifugar a temperatura ambiente durante 10 minutos, 8000rpm
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Tomar el sobrenadante, añadir un volumen igual de alcohol isopropílico y colocar a 15-30 grados durante 10 minutos
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Centrifugar a 12000g. durante 10 minutos
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Desechar el sobrenadante y añadir 10ml de alcohol al 75% para lavar el precipitado
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Centrifugar a. 2-8 grados centígrados, no más de 7500g durante 5 minutos
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p>Desechar el sobrenadante y secar el precipitado durante 10 minutos
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Disolver en agua DEPC
Método 2, hojas de plantas viejas, raíces o polisacáridos Aislamiento de ARN total a partir de materiales con alto contenido
Muela 1g de tejido en nitrógeno líquido. y añadir 6ML de tampón de extracción
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Agitar durante 2 minutos
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65℃, 20min
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Añadir 1.5MLKAc
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Mezclar bien y mantener en baño de hielo durante 20min
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8000 rpm, 4 ℃, 15 min
Tome el sobrenadante, agregue 0,6 veces alcohol isopropílico, -20 ℃, 1 hora (o temperatura ambiente 15-20 min)
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12000rpm, 4℃, 15min
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Etanol al 75%, 12000rpm, 20℃, 5min
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Secar, disolver 60ul DEPC en agua, 15 min
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12000 rpm, 4 ℃, 5 min, el sobrenadante es RN
A., 10 Para evitar la degradación del ARN, utilice el eliminador de ARNasa exógena de Huayueyang para manipular consumibles, utensilios, encimeras, etc. ,0,¿Cuáles son los pasos clave y las precauciones en el proceso de extracción de ARN?
Experimento de extracción con álcali diluido