Manipulación de consumibles antes de la extracción de ARN
Procesamiento de la muestra:
A. Tejido vegetal: triturar 100 mg de tejido fresco o congelado a -70 °C en nitrógeno líquido, agregar el polvo a 1 ml de solución de lisis. y mezclar bien.
B. Tejido animal: Añadir 1 ml de solución de lisis a 100 mg de tejido animal fresco o congelado a -70°C y homogeneizar con un mortero u homogeneizador.
c.Células adherentes: Añadir solución de lisis directamente a la placa de cultivo para lisar las células, añadir 1ml de solución de lisis por cada 106 células. Soplar con una muestra y mezclar bien.
d. Suspensión celular: centrifugar para recoger las células. Añadir 1 ml de tampón de lisis por cada 106 células animales, vegetales y de levadura o cada 107 células bacterianas y mezclar bien.
E. Procesamiento de sangre: tomar 0,2-1 ml de sangre fresca, agregar 3 veces de solución de lisis de glóbulos rojos, mezclar bien, dejar reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos y centrifugar a 10.000 rpm durante 1 minuto. . Deseche el sobrenadante si el sedimento contiene glóbulos rojos, agregue 2 veces el tampón de lisis de glóbulos rojos y repita el paso de lisis. Después de la centrifugación, añadir 1 ml de tampón de lisis al precipitado y mezclar bien.
Dejar la muestra tratada a temperatura ambiente durante 5 minutos para separar completamente los complejos ácido nucleico-proteína.
Añadir 0,2ml de cloroformo a la muestra homogeneizada, tapar el tubo de ensayo, agitar vigorosamente durante 65438±05 segundos y dejar a temperatura ambiente durante 3-5 minutos.
Centrifugar a 12.000 rpm durante 10 minutos a 2-8°C. El ARN se encuentra principalmente en la fase acuosa incolora superior, por lo tanto, transfiera la fase acuosa a un tubo de ensayo nuevo y no aspire el precipitado.
Pretratamiento de la columna de adsorción: añadir 500 ul de solución de lavado de columna a la columna de adsorción, dejar reposar a temperatura ambiente durante 2 minutos, centrifugar a 12000 rpm durante 2 minutos a 2-8 °C y desechar el líquido residual. . 6. Añadir 200 ul de etanol absoluto al sobrenadante recogido en el paso 4, mezclar bien, añadir a la columna de adsorción, dejar reposar durante 2 minutos, centrifugar a 12000 rpm durante 2 minutos a 2-8°C y desechar el líquido residual. 7. Agregue 600 ul de solución de enjuague a la columna de adsorción (verifique si se ha agregado etanol absoluto antes de usar), centrifugue a 12000 rpm durante 2 minutos a 2-8 °C y deseche el líquido residual. 8. Agregue 600 ul de solución de lavado a la columna de adsorción, centrifugue a 12000 rpm durante 2 minutos a 2-8°C y deseche el líquido residual. 9. Centrifugue a 12.000 rpm durante 2 minutos, deseche el tubo de recolección y coloque la columna de adsorción a temperatura ambiente durante unos minutos para eliminar el líquido de enjuague residual en la columna de adsorción. 10. Coloque la columna de adsorción en un tubo nuevo, deje caer 50-100 ul de ddH2O libre de ARNasa en el centro de la membrana, déjela a temperatura ambiente durante 5 minutos y centrifugue a 12000 rpm durante 2 minutos para obtener ARN.
Notas:
Todos los equipos y consumibles relacionados deben ser productos libres de RNasa. Tenga cuidado durante la operación y use máscaras y guantes para evitar la contaminación de las muestras con RNasa en el medio ambiente.
El valor de DO del ARN en solución acuosa puede estar entre 1,5-1,9, pero esto no significa que el ARN sea impuro y requiera detección por electroforesis.