La proteómica cuantitativa TMT facilita la investigación sobre el mecanismo molecular de la interacción PRV-célula huésped
Título del artículo: Análisis proteómico cuantitativo basado en etiquetas de masa en tándem de células PK15 knockout ISG15 en la infección por el virus de la pseudorabia
Método técnico: proteómica cuantitativa de etiquetado TMT
Passion Biotech y la Universidad Agrícola de Henan colaboraron y publicaron recientemente resultados de investigación sobre el mecanismo molecular de interacción entre PRV y células huésped a través de la proteómica en "Genes".
El virus de la pseudorrabia porcina (PRV) es una enfermedad infecciosa aguda que se presenta principalmente en cerdos y supone una grave amenaza para la industria porcina mundial. Las vacunas comerciales existentes tampoco logran impedir la aparición de nuevas cepas de PRV. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevos medios y estrategias para controlar la propagación del PRV.
Hasta la fecha, existen pocos estudios que utilicen la proteómica para analizar el mecanismo de interacción PRV-célula huésped. Por lo tanto, este artículo utiliza el método de proteómica cuantitativa de etiquetado TMT para comparar las diferencias en la expresión de proteínas en las células huésped después de la infección por PRV, proporcionando una base teórica para revelar aún más la patogénesis de PRV y posibles objetivos antivirales.
Ruta técnica
1. Diferencias en la expresión de proteínas celulares inducidas por PRV
Con el fin de analizar los cambios en la expresión de proteínas de la célula huésped durante la infección por PRV, este artículo Las células ISG15-/--PK15 analizadas (células PK15 knockout para ISG15) se sometieron a análisis proteómico (Figura 1A). En el grupo de comparación PRV y Mock, se identificaron 4958 péptidos y se seleccionaron 241 proteínas expresadas diferencialmente (diferencia de veces > 1,2 o <0,83, valor de P <0,05 en comparación con el grupo Mock, ISG15 In -/-- infectado con PRV). En las células PK15, 162 proteínas diferenciales estaban significativamente reguladas al alza y 79 proteínas diferenciales estaban significativamente reguladas a la baja (Figura 1B).
Figura 1 Gráfico de volcán y mapa de calor de agrupamiento
2. Verificación por RT-qPCR y Western Blot
Para garantizar la confiabilidad de los datos proteómicos, se utilizaron ocho proteínas aleatorias ( AFP, Hsp40, Herc5, Mcc1, Vtn, Strap, Fn1 e IL18) se seleccionaron para la verificación por RT-qPCR y Western blot. Además, se seleccionó la proteína PRV-gE para verificar la replicación de PRV. Como se muestra en la Figura 2, los resultados de RT-qPCR y Western blot fueron consistentes con la proteómica cuantitativa TMT (Figura 2). Los resultados anteriores muestran que la DEP analizada mediante el método de etiquetado TMT tiene una alta credibilidad.
Figura 2? RT-qPCR y verificación de Western blot
3. Análisis de enriquecimiento de proteínas diferenciales en GO
Las funciones de GO se pueden dividir en procesos biológicos (BP) , componente celular (CC) y función molecular (MF). El análisis de enriquecimiento de GO se realizó en proteínas expresadas diferencialmente en procesos biológicos, las proteínas diferenciales se enriquecieron principalmente en procesos biológicos individuales, procesos metabólicos, procesos del sistema inmunológico, procesos multicelulares y procesos de desarrollo. En la composición celular se enriquecen principalmente términos como partes celulares, orgánulos, matriz extracelular, fibras supramoleculares y conexiones celulares. Entre las funciones moleculares, las proteínas diferenciales se enriquecieron significativamente en actividad de unión, actividad catalítica, reguladores de funciones moleculares, actividad de moléculas estructurales, actividad de transporte y actividad antioxidante (Figura 3).
Figura 3 Análisis de enriquecimiento GO
4. Análisis de enriquecimiento KEGG de proteínas diferenciales
Los resultados del análisis de enriquecimiento KEGG mostraron que 241 proteínas expresadas diferencialmente se enriquecieron significativamente. en 7 vías, incluida la vía de señalización PI3K-Akt, la vía de adhesión focal, la cascada del complemento y la coagulación, la vía de unión estrecha, la regulación del citoesqueleto de actina, la interacción del receptor de la matriz extracelular (ECM) y la absorción de la digestión de carbohidratos (Fig. 4A). Como se muestra en la Figura 4B, las proteínas diferenciales se enriquecieron principalmente en la vía de señalización PI3K y en las vías de reacción en cascada del complemento y de la coagulación (Figura 4B).
Figura 4 ?Análisis de enriquecimiento KEGG y análisis de red PPI
Para aclarar aún más las interacciones entre proteínas expresadas diferencialmente, realizamos análisis de red PPI en proteínas expresadas diferencialmente. Como se muestra en la Figura 4C, las proteínas expresadas diferencialmente se asignaron a dos redes de interacción funcionales principales, POP1-SURF6-RPL7L1-ISG15-CCL5-C5-C9-CFB-F5-APOB-IGFBP7 relacionadas con la inmunidad innata y el ciclo celular y el componente celular. Red INCENP-KIF20A-PCLAF-ISG15-CCL5-IL18 relacionada. En particular, hay al menos cuatro proteínas centrales en estas dos redes: ISG15, CCL5, GRWD1 y C5 (Figura 4C). En la red PPI, hay cinco proteínas con fuertes interacciones relacionadas con la respuesta inmune y la replicación de PRV, a saber, ISG15, CCL5, C5, C9 y AFP. En conjunto, estos resultados ayudan a dilucidar la interacción entre PRV y el huésped y proporcionan una base teórica para el mecanismo de evasión inmune del huésped inducido por PRV.