Principios y pasos de RT PCR

Principio: RT-PCR es la abreviatura de PCR con transcripción inversa y PCR en tiempo real. La PCR con transcripción inversa o PCR con transcripción inversa (RT-PCR) es una variante ampliamente utilizada de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En la RT-PCR, una cadena de ARN se transcribe de forma inversa en ADN complementario, que luego se utiliza como plantilla para la amplificación del ADN mediante PCR.

Pasos: (a) Predesnaturalización:

Destruir la estructura secundaria del ADN que es difícil de destruir. Una desnaturalización suficiente del ADN puede reducir el impacto de la estructura compleja del ADN en la amplificación y permitir que los cebadores se unan mejor a la plantilla. Además, en algunas reacciones que utilizan la enzima Taq de inicio en caliente, la enzima Taq se puede activar para que la reacción de PCR se desarrolle sin problemas.

(2) Ciclo de desnaturalización-recocido-extensión:

① Desnaturalización del ADN molde: calentar el ADN molde a 93 °C durante un cierto período de tiempo para amplificar la doble cadena. El ADN molde formado por PCR o el ADN bicatenario se disocia en hebras simples para combinarlos con cebadores y prepararlo para la siguiente ronda de reacción.

② Recocido (desnaturalización) del ADN molde y los cebadores: Calor y desnaturalización; el ADN molde se divide en hebras simples. La temperatura desciende a aproximadamente 55 °C y el cebador se empareja con la secuencia complementaria monocatenaria del ADN molde;

③Extensión del cebador: el conjugado cebador-plantilla de ADN utiliza dNTP como reactivo bajo la acción de la ADN polimerasa Taq, utilizando la secuencia objetivo como plantilla, de acuerdo con los principios de emparejamiento de bases y replicación semiconservativa, sintetiza una nueva copia semiconservadora que es complementaria a la cadena de ADN plantilla y complétala. bajo la acción de la enzima PCR, utilizando dNTP como reactivo y utilizando la secuencia objetivo como plantilla, se sintetiza una nueva cadena de replicación semiconservativa complementaria al ADN plantilla basándose en los principios de emparejamiento de bases y replicación semiconservativa. (C) Ciclo de amplificación del instrumento de PCR después de 10 min de extensión a 72 grados.