Cómo funciona la transferencia Western
La separación electroforética de proteínas es una de las tecnologías de purificación y separación bioquímica importantes. La electroforesis es el fenómeno en el que partículas cargadas se mueven hacia electrodos con cargas opuestas bajo la influencia de un campo eléctrico. Dependiendo del soporte utilizado, existen electroforesis en gel de agarosa, electroforesis en gel de almidón, electroforesis en gel de poliacrilamida, etc. Entre ellos, la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) no requiere electroósmosis y requiere una pequeña cantidad de muestra (1-100 μg). Alta resolución, puede detectar muestras de 10-9-10-12 moles. El gel tiene alta resistencia mecánica y buena repetibilidad. Ajustando la concentración de monómero o la proporción de monómero a agente reticulante, se pueden obtener geles con diferentes tamaños de poro. -¿Vaya? Q9v
SDS-PAGE es un método de electroforesis comúnmente utilizado para el análisis cualitativo de proteínas, especialmente adecuado para la detección de la pureza de las proteínas y la determinación del peso molecular. {sQ
Las proteínas se pueden separar eficazmente mediante PAGE basándose principalmente en diferencias en el peso molecular y la carga, mientras que el principio de separación de SDS-PAGE solo se basa en diferencias en el peso molecular de la proteína, porque la solución de procesamiento de muestras de SDS-PAGE contiene SDS y mercaptoetanol (2-ME) o dimercaptotriol (DTT) en la muestra que se va a someter a electroforesis. Puede romper los enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína y destruir la estructura cuaternaria de las proteínas. SDS es un tensioactivo aniónico, es decir, un detergente. Puede romper los enlaces de hidrógeno intra e intermoleculares, destruir las estructuras secundarias y terciarias de las moléculas de proteínas, combinarse con la parte hidrófoba de las proteínas y destruir su estructura plegable. Si la muestra de electroforesis está en un tampón de muestra, se debe hervir en agua hirviendo durante 3 a 5 minutos para combinar completamente el SDS con la proteína para formar un complejo de proteína SDS. En presencia del fuerte agente reductor mercaptoetanol, los enlaces disulfuro en las moléculas de proteína del complejo de proteína SDS se abren sin oxidarse. La proteína se desnaturaliza por completo y se despolimeriza para formar una estructura similar a la avellana, que existe de forma estable y homogénea. solución. Después de que el SDS se une a la proteína, el complejo SDS-proteína lleva una gran cantidad de cargas negativas. En promedio, una molécula de SDS está unida a cada dos residuos de aminoácidos. En este momento, las cargas de varias moléculas de proteínas están completamente cubiertas por SDS, superando con creces sus cargas originales, de modo que se pueden ignorar las cargas originales de las proteínas y se pueden eliminar las diferencias de carga originales entre diferentes moléculas. Su movilidad electroforética depende principalmente del peso molecular de las subunidades, por lo que las bandas separadas también son subunidades de la proteína.
Generalmente se añade colorante azul de bromofenol a la solución de tratamiento de muestras. El indicador azul de bromofenol es una molécula pequeña que puede pasar libremente a través de los poros del gel y, por lo tanto, muestra una posición de vanguardia en la electroforesis. La electroforesis se puede detener cuando el indicador llega al fondo del gel. \$?@ gt ampA
Además, se puede agregar una cantidad adecuada de glicerol o sacarosa a la solución de procesamiento de muestras para aumentar la densidad de la solución de modo que la solución de muestra se hunda hasta el fondo del recipiente de muestreo. tanque al agregar muestras.
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