Experimentos de interferencia de ARN, cuantas más líneas celulares elijas, mejor
Experimentos de interferencia de ARN: cuantas más líneas celulares se seleccionen, mejor.
Los experimentos de recuperación de interferencia de ARN sirven principalmente para ilustrar el efecto fuera del objetivo. Los efectos fuera del objetivo fueron propuestos por primera vez por el científico de Dharmacon Jackson y sus colegas (Fedorov, Y., et al. Off-targeting By siRNA Can Induce Toxic Phenotype. RNA Accepted (2006).) Transfectaron células después de un solo siRNA de un específico gen, se utiliza tecnología de detección de chips de genoma completo para identificar el número de genes diana cuya expresión está regulada hacia arriba o hacia abajo de 1,5 a 3 veces. Los investigadores descubrieron que una gran cantidad de genes no estaban regulados específicamente en esta situación. Los niveles complementarios de la cadena sentido y la cadena antisentido de ARNip a genes fuera del objetivo varían de mayor a menor, y los perfiles de expresión de genes fuera del objetivo desencadenados por cada ARNip también son diferentes, lo que refleja efectos fuera del objetivo dependientes de la secuencia.
En pocas palabras, el efecto fuera del objetivo significa que la secuencia de shRNA que interfiere ingresa a la vía del microARN. A través de la vía del microARN, puede regular la expresión de una gran cantidad de genes objetivo sin estar completamente restringido. complementariedad. Originalmente, se requería que una secuencia de ARN de 19 a 23 nt fuera completamente complementaria para que se produjera la interferencia. Sin embargo, si ingresa a la ruta del microARN, solo de 11 a 15 nt para ser complementaria pueden producir un efecto de interferencia. con genes no objetivo y provocar el silenciamiento de genes no objetivo, lo que provoca que se pierda el objetivo. Si algunos de los genes afectados por la interferencia fuera del objetivo se encuentran en la misma vía de señalización que el gen objetivo, o tienen funciones biológicas similares a las del gen objetivo, entonces, si otros genes se ven interferidos debido a la interferencia fuera del objetivo, será también causan cambios fenotípicos en las mismas células que aquellas después de que se interfiere con el gen objetivo. De hecho, es posible que la secuencia de shRNA seleccionada no interfiriera eficazmente con el gen diana, o aunque interfiriera con el gen diana, no provocara los cambios esperados en el fenotipo celular.
Con base en las razones anteriores, desde que los investigadores descubrieron y reconocieron ampliamente el efecto Off-target, cada vez más revistas exigen que los investigadores tengan los controles correspondientes para ilustrar el efecto Off-target al enviar manuscritos. Es decir, debe tener controles o experimentos relevantes para demostrar que los resultados experimentales que obtuvo no se deben al efecto fuera del objetivo.