Precauciones para la operación experimental de RT-PCR

Las tecnologías de extracción de ARN y RT-PCR se utilizan al realizar experimentos de hibridación Northern, construir bibliotecas de ADNc, obtener genes que puedan codificar proteínas eucariotas y obtener genes de virus ARN.

El genoma de los eucariotas es ADN. ¿Por qué no obtener los genes que necesitamos directamente de la PCR del ADN? Debido a que los genes eucariotas contienen una gran cantidad de regiones no codificantes, llamadas intrones, los segmentos codificantes de proteínas reales están separados por estos intrones, y estas regiones codificantes se denominan exones. Después de que el ADN eucariótico se transcribe en ARN, estas regiones no codificantes se eliminan mediante corte y empalme para formar ARNm maduro, que luego se traduce en proteína.

Así, si se obtiene directamente el gen diana del ADN genómico de organismos eucariotas, lo clona y lo expresa, intentar obtener la proteína diana no funcionará, porque el ADN obtenido contendrá regiones no codificantes. Para expresar genes eucariotas y las proteínas correspondientes, la única forma es extraer su ARNm y realizar RT-PCR, que es un proceso laborioso.

1. Extracción de ARN

El principio de extracción de ARN es en realidad muy simple: romper células o tejidos con un desnaturalizante, luego extraer el ARN a través de disolventes orgánicos como el cloroformo, luego precipitar, lavar, secar y finalmente disolver. Sin embargo, dado que la RNasa es ubicua y puede degradar el ARN en cualquier momento, hay muchas cosas a las que se debe prestar atención durante el experimento. Si es un poco negligente, todos sus esfuerzos serán en vano.

1.1 Aislamiento de ARN de alta calidad

La síntesis exitosa de ADNc proviene de ARN de alta calidad. El ARN de alta calidad debe tener al menos su longitud completa y estar libre de inhibidores de la transcriptasa inversa, como EDTA o SDS. La calidad del ARN determina la cantidad máxima de información de secuencia que se puede transcribir en ADNc. El método general de purificación de ARN es un método de un solo paso que utiliza isotiocianato de guanidina/fenol ácido.

Generalmente no es necesario utilizar oligo(dT) para aislar selectivamente el ARN poli(A). Los resultados de la amplificación se pueden detectar independientemente de si la plantilla inicial es ARN total o ARN poli(A). Además, el aislamiento de ARN poli(A) provocará fluctuaciones en la abundancia de ARNm entre muestras, sesgando así la detección y cuantificación de la información. Sin embargo, al analizar ARNm raros, el ARN poli(A) aumenta la sensibilidad de detección.

1.2 El factor más importante que afecta la extracción de ARN: la RNasa

En todos los experimentos de ARN, el factor más crítico es aislar el ARN de longitud completa. La principal razón del fracaso del experimento fue la contaminación por ribonucleasa (RNasa). Dado que la RNasa está muy extendida y es estable, puede resistir una variedad de tratamientos sin ser inactivada, como hervir, esterilizar en autoclave, etc. Las reacciones catalizadas por RNasa generalmente no requieren cofactores. Por lo tanto, siempre que haya una pequeña cantidad de RNasa en la preparación de ARN, provocará la degradación del ARN durante el proceso de preparación y análisis. La pureza y la integridad del ARN preparado pueden afectar directamente los resultados del análisis de ARN. La preparación y el análisis del ARN son difíciles.

En el experimento, por un lado, se debe controlar estrictamente la contaminación de la RNasa exógena; por otro, se debe inhibir al máximo la RNasa endógena. La ARNasa exógena existe en el sudor, la saliva, etc. de las manos del operador, y también puede existir en el polvo. Las RNasas utilizadas en otros experimentos de biología molecular también pueden causar contaminación. Estas RNasas exógenas pueden contaminar instrumentos, productos de vidrio, productos de plástico, tanques de electroforesis, manos de investigadores y diversos reactivos. Varios tejidos y células contienen una gran cantidad de RNasas endógenas.

1.3 Inhibidores de la RNasa de uso común

* Pirocarbonato de dietilo (DEPC): Es un inhibidor de la RNasa potente pero incompleto. Desnaturaliza las proteínas uniéndose al anillo imidazol de la histidina, el grupo activo de la RNasa, inhibiendo así la actividad enzimática.

*Isotiocianato de guanidina: Considerado actualmente el inhibidor de la RNasa más eficaz, lisa el tejido a la vez que inactiva la RNasa.

No sólo puede destruir estructuras celulares y disociar ácidos nucleicos de proteínas nucleares, sino que también tiene un fuerte efecto desnaturalizante sobre la ARNasa.

* Complejo de ribonucleósido de oxovanadio: complejo formado por iones de óxido de vanadio y nucleósidos que se combina con la RNasa para formar una sustancia en estado de transición que puede inhibir casi por completo la actividad de la RNasa.

*Inhibidor de la proteína RNasa (RNasin): una glicoproteína ácida extraída del hígado de rata o de la placenta humana. RNasin es un inhibidor no competitivo de la RNasa y puede unirse a una variedad de RNasas para inactivarlas.

*Otros: SDS, urea, tierra de diatomeas, etc. también tienen cierto efecto inhibidor sobre la RNasa.

1.4 Medidas para prevenir la contaminación por ARNasa, precauciones y preparativos necesarios antes de la extracción de ARN

* Intente establecer un área dedicada a la operación de ARN en el laboratorio, centrifugar, transferir recipientes de líquidos, reactivos, etc. deben usarse exclusivamente. El área de operación de RNA debe mantenerse limpia y esterilizada con regularidad.

* Siempre se deben usar guantes y máscaras de goma desechables durante la operación y reemplazarlos con frecuencia para evitar que las bacterias y hongos en las manos y los brazos, así como la ARNasa secretada por el cuerpo humano, ingresen a varios contenedores o equipos contaminadores. . Trate de evitar el uso de guantes de plástico desechables. Los guantes de plástico no sólo suelen traer inconvenientes a las operaciones, sino que las partes adicionales de los guantes de plástico a menudo transfieren las partes del instrumento que contienen RNasa a las partes libres de RNasa, expandiendo la contaminación.

* Procura utilizar productos de plástico desechables y evita utensilios desechables como papel filtro, puntas, tubos, etc. para evitar la contaminación cruzada. Por ejemplo, los investigadores que trabajan con sondas de ARN suelen utilizar RNasa H, T1, etc., lo que es muy probable que provoque contaminación de pipetas, centrífugas, etc. durante la operación. Estos equipos contaminados son enemigos de la manipulación del ARN.

* Respecto a los productos de plástico desechables, se recomienda utilizar puntas y tubos suministrados por el fabricante y que hayan sido esterilizados antes de salir de fábrica. Los productos de plástico estériles suministrados por la mayoría de los fabricantes tienen poca contaminación por ARNasa y pueden usarse directamente para operaciones de ARN después de la compra. Los productos plásticos tratados con DEPC a menudo contienen RNasa debido a una contaminación secundaria, lo que provoca fallos experimentales.

*Todos los artículos de vidrio deben hornearse en seco a 180 ℃ durante 6 horas o más antes de su uso.

*Los utensilios que no se pueden tratar con DEPC se pueden limpiar varias veces con cloroformo, lo que normalmente puede eliminar la actividad de la RNasa.

*El etanol, alcohol isopropílico, Tris, etc. utilizados para preparar la solución deben ser reactivos embotellados nuevos y sin abrir.

*Los utensilios de plástico se pueden remojar en agua 0,1 DEPC o enjuagar con cloroformo (nota: no se pueden utilizar utensilios de vidrio orgánico porque pueden corroerse con el cloroformo).

*Los tanques de electroforesis de plexiglás, etc., se pueden lavar primero con detergente, enjuagar con agua bidestilada, secar con etanol, luego remojar en 3 H2O2 a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego enjuagar con 0,1 DEPC. agua y secado.

*La solución preparada debe utilizar 0,1 DEPC en la medida de lo posible y tratarse a 37°C durante más de 12 horas. A continuación, el DEPC residual se elimina mediante autoclave. Los reactivos que no se pueden esterilizar en autoclave deben prepararse con agua bidestilada estéril tratada con DEPC y luego filtrarse y esterilizarse a través de una membrana de filtro de 0,22 μm.

1.5 Pasos generales para la extracción de ARN

Los pasos generales para la extracción de ARN son: romper tejido → aislar ARN → precipitar ARN → lavar ARN → fundir ARN → preservar ARN

La disrupción del tejido y la inactivación de la RNasa se pueden llevar a cabo simultáneamente. Se pueden usar clorhidrato de guanidina, tiocianato de guanidina, NP-40, SDS, proteinasa K, etc. para alterar el tejido.

Aislar la mitad del ARN utilizando disolventes orgánicos como fenol y cloroformo, y añadir una pequeña cantidad de alcohol isoamílico. Tras este paso y la centrifugación, el ARN se distribuye generalmente en la capa superior y se separa de la proteína. capa.

Para precipitar el ARN se utiliza generalmente etanol, NaAc 3M (pH-5,2) o alcohol isopropílico.

Lavar el ARN con etanol al 70%. A veces, para evitar que el ARN se elimine, se puede omitir este paso. Después del lavado, se puede secar o hornear con etanol, pero no debe ser así. Demasiado seco, de lo contrario no será fácil de disolver.

El TE se utiliza generalmente para fundir el ARN.

El ARN debe almacenarse lo más bajo posible. Para evitar la contaminación por trazas de RNasa, el ARN aislado de muestras ricas en RNasa (como páncreas e hígado) debe almacenarse en formaldehído para preservar el ARN de alta calidad, especialmente para el almacenamiento a largo plazo. El ARN extraído del hígado de rata básicamente se degradó después de almacenarse en agua durante una semana, mientras que el ARN extraído del bazo de rata permaneció estable después de almacenarse en agua durante 3 años. Además, las transcripciones de más de 4 kb son más sensibles a la degradación por trazas de RNasa que las transcripciones pequeñas. Para aumentar la estabilidad de las muestras de ARN almacenadas, el ARN se puede disolver en formamida desionizada y almacenar a -70 °C. La formamida utilizada para preservar el ARN no debe contener impurezas que degraden el ARN. El ARN derivado del páncreas se puede almacenar en formamida durante al menos un año. Cuando el ARN esté listo para usarse, se puede utilizar el siguiente método para precipitar el ARN: agregar NaAc a 0,3 M y centrifugar a 12.000 × g durante 5 minutos.

1.6 Nuevo método de extracción de ARN - Método TRIZOL

El reactivo TRIZOL es un reactivo para extraer ARN total directamente de células o tejidos. Mantiene la integridad del ARN mientras altera y lisa las células. Después de agregar cloroformo y centrifugar, la muestra se divide en una capa acuosa y una capa orgánica. El ARN está presente en la capa acuosa. Después de recoger la capa acuosa superior, el ARN se puede reducir mediante precipitación con isopropanol. Después de eliminar la capa de muestra de agua, el ADN y las proteínas de la muestra también se pueden reducir mediante precipitación. La precipitación con etanol puede precipitar el ADN en la capa intermedia y la adición de alcohol isopropílico a la capa orgánica puede precipitar la proteína. ***El ADN purificado es útil para estandarizar los rendimientos de ARN entre muestras.

TRIZOL es tóxico y puede provocar quemaduras si entra en contacto con la piel o se ingiere accidentalmente. Una vez en contacto con la piel, lavar inmediatamente con abundante detergente y agua. TRIZOL es estable durante 12 meses a temperatura ambiente. Sin embargo, para obtener mejores resultados, se recomienda almacenarlo entre 2 y 8 °C.

2． RT-PCR

RT-PCR se refiere a un método que combina la reacción de transcripción inversa (Transcripción Inversa; RT) y la reacción de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa).

2.1 Principio de la RT-PCR

La RT-PCR combina la síntesis de ADNc con ARN como plantilla y PCR, proporcionando un método rápido y sensible para analizar la expresión génica. La RT-PCR se utiliza para detectar o cuantificar información de expresión. Además, esta tecnología también se puede utilizar para detectar diferencias en la expresión génica o clonar ADNc sin construir una biblioteca de ADNc. La RT-PCR es más sensible y más fácil de operar que otras técnicas de análisis de ARN, incluida la transferencia Northern, el análisis de protección de ARNasa, la hibridación in situ y el análisis de nucleasa S1.

La plantilla para RT-PCR puede ser ARN total o ARN selectivo poli(A). La reacción de transcripción inversa puede utilizar la transcriptasa inversa y comenzar con cebadores aleatorios, oligo(dT) o cebadores específicos de genes (GSP). La RT-PCR se puede realizar como método de uno o dos pasos. En la RT-PCR de dos pasos, cada paso se realiza en condiciones óptimas. La síntesis de ADNc se realizó primero en un tampón de transcripción inversa y luego se extrajo 1/10 del producto de reacción para PCR. En la RT-PCR de un solo paso, la transcripción inversa y la PCR se realizan secuencialmente en un tubo en condiciones optimizadas tanto para la transcripción inversa como para la PCR.

2.2 Pasos de RT-PCR

⑴Agregue 4uL de plantilla de ARN, 2uL de cebadores y 5uL de agua desionizada al tubo de centrífuga bañado en hielo, mezcle bien y centrifugue durante 3-5 segundos. ;

⑵Baño de agua a 70 grados durante 5 minutos y baño de hielo durante 30 segundos (esto es para que los cebadores y las plantillas se emparejen correctamente);

⑶Agregue 4uL de solución de reacción 5X y 1 ul de inhibidor de RNasa, 2 ul de dNTP (estos deben prepararse primero y luego dividirse en cada tubo) y mezclar en un baño de agua a 37 grados durante 5 minutos, agregar 1 ul de transcriptasa inversa AMV-RT y mezclar;

⑸Baño de agua a 37 grados durante 1 hora (este paso es el proceso de transcripción inversa);

⑹Termina la reacción a 70 grados durante 10 minutos (esto es para inactivar la actividad enzimática; evitar interferencias con experimentos posteriores), coloque el producto en hielo para el siguiente experimento de PCR y almacene el resto a -70 grados.

2.3 Diseño de cebadores para RT-PCR

El diseño de cebadores de RT-PCR y el diseño de cebadores de PCR general pueden seguir los mismos principios. El diseño cuidadoso del cebador es el paso más importante en la PCR. Un par de cebadores ideales se hibrida sólo con una única secuencia a cada lado de la secuencia de interés y no con otras secuencias. Los cebadores mal diseñados pueden amplificar otras secuencias no objetivo. Todos los cebadores idealmente diseñados tienen las mismas características siguientes, mientras que los cebadores fallidos tienen sus propias desventajas:

* Los cebadores típicos tienen de 18 a 24 nucleótidos de largo. Los cebadores deben ser lo suficientemente largos para garantizar la unicidad de la secuencia y reducir la posibilidad de que la secuencia esté presente en sitios de secuencia no objetivo. Pero los cebadores de más de 24 nucleótidos no significan una mayor especificidad. Las secuencias más largas pueden hibridarse con secuencias desapareadas, lo que reduce la especificidad, e hibridarse más lentamente que las secuencias cortas, lo que reduce los rendimientos.

* Seleccione cebadores con un contenido de GC del 40% al 60% o un contenido de GC que refleje el contenido de GC de la plantilla.

* Diseñar cebadores con G o C en el extremo 5' y la región media. Esto aumentará la estabilidad del cebador y la estabilidad de la hibridación del cebador con la secuencia diana.

*Evita la presencia de secuencias complementarias en el extremo 3' del par de cebadores, que formarán dímeros de cebador e inhibirán la amplificación.

*Evita las puntas 3' ricas en GC. Al diseñar cebadores, asegúrese de que haya 3 A o T en los últimos 5 nucleótidos.

*Evita el mal emparejamiento del extremo de 3'. El nucleósido 3' necesita hibridarse con la plantilla para la extensión catalizada por la polimerasa.

* Evite secuencias que puedan crear estructuras secundarias internas, que pueden desestabilizar el recocido del cebador.

Se pueden añadir secuencias adicionales que no existen en la secuencia diana, como sitios de restricción y secuencias promotoras, al extremo 5' del cebador sin afectar la especificidad. Estas secuencias no se incluyen al calcular los valores de Tm del cebador, pero se deben verificar la complementariedad y la estructura secundaria interna.

La estabilidad de la imprimación depende de las condiciones de almacenamiento. Los polvos secos y las imprimaciones disueltas deben almacenarse a -20°C. Los cebadores disueltos en TE en una concentración superior a 10 μM se pueden almacenar de manera estable durante 6 meses a -20 °C, pero solo se pueden almacenar durante menos de 1 semana a temperatura ambiente (15 °C a 30 °C). Las imprimaciones en polvo seco se pueden almacenar a -20°C durante al menos 1 año y a temperatura ambiente (15°C a 30°C) hasta 2 meses.

2.4 Temperatura de recocido del cebador

Otro parámetro importante de los cebadores es la temperatura de fusión (Tm). Esta es la temperatura a la que el 50% de los cebadores y secuencias complementarias aparecen como moléculas de ADN de doble cadena. Tm es necesario para establecer la temperatura de recocido de la PCR. Idealmente, la temperatura de hibridación debería ser lo suficientemente baja para garantizar una hibridación eficaz del cebador con la secuencia diana y lo suficientemente alta para reducir la unión no específica. La temperatura de recocido razonable es de 55 ℃ a 70 ℃. La temperatura de recocido generalmente se establece 5°C por debajo de la Tm de la imprimación.

La Tm variará mucho dependiendo de la fórmula utilizada y la secuencia del cebador. Debido a que la mayoría de las fórmulas proporcionan una estimación de Tm, todas las temperaturas de recocido son sólo un punto de partida. La especificidad se puede mejorar analizando varias reacciones con aumentos graduales en la temperatura de recocido. Comience 5°C por debajo de la Tm estimada y aumente gradualmente la temperatura de recocido en incrementos de 2°C. Las temperaturas de recocido más altas reducen la formación de dímeros de cebador y productos no específicos.

Para obtener mejores resultados, ambos cebadores deben tener valores de Tm similares. Los pares de cebadores con diferencias de Tm de más de 5 °C presentarán inicios en falso significativos debido al uso de temperaturas de recocido más bajas en el ciclo. Si los dos cebadores tienen Tm diferentes, ajuste la temperatura de recocido a 5 °C por debajo de la Tm más baja. O para mejorar la especificidad, se pueden realizar 5 ciclos a una temperatura de hibridación diseñada según una Tm más alta, y luego los ciclos restantes se pueden realizar a una temperatura de hibridación diseñada según una Tm más baja. Esto permite obtener copias parciales de la plantilla de destino en condiciones más estrictas.

2.5 Aumentar la temperatura de mantenimiento de la transcripción inversa

Una temperatura de mantenimiento más alta ayuda a abrir la estructura secundaria del ARN y aumenta el rendimiento de la reacción. Para la mayoría de las plantillas de ARN, la incubación del ARN y los cebadores a 65 °C sin tampón ni sal, seguida de un enfriamiento rápido en hielo, eliminará la mayor parte de la estructura secundaria, lo que permitirá que los cebadores se unan. Sin embargo, algunas plantillas seguirán teniendo una estructura secundaria, incluso después de la desnaturalización térmica. Las temperaturas de incubación más altas también pueden aumentar la especificidad, especialmente cuando se utilizan cebadores específicos de genes (GSP) para la síntesis de ADNc. Si utiliza GSP, asegúrese de que la Tm de los cebadores sea la misma que la temperatura de incubación esperada. No utilice oligo(dT) ni cebadores aleatorios por encima de 60 °C. Los cebadores aleatorios deben incubarse a 25 °C durante 10 minutos antes de aumentar a 60 °C. Además de utilizar una temperatura de transcripción inversa más alta, también puede mejorar la especificidad moviendo directamente la mezcla de ARN/cebador desde la temperatura de desnaturalización de 65 °C a la temperatura de incubación de transcripción inversa y agregando una mezcla de reacción 2X precalentada (síntesis de inicio en caliente de ADNc). ). Este enfoque ayuda a prevenir el emparejamiento de bases intermoleculares que se produce a temperaturas más bajas. El uso de un instrumento de PCR puede simplificar los múltiples cambios de temperatura necesarios para la RT-PCR.

2.6 Aditivos que promueven la transcripción inversa

Se añaden aditivos que incluyen glicerol y DMSO a la reacción de síntesis de la primera cadena para reducir la estabilidad de la doble cadena del ácido nucleico y desenredar el ARN. estructura secundaria, se puede agregar hasta un 20% de glicerol o un 10% de DMSO sin afectar la actividad de MMLV. AMV también puede tolerar hasta un 20% de glicerol sin reducir la actividad. Para maximizar la sensibilidad de la RT-PCR en la reacción de transcripción inversa, se puede agregar glicerol al 10% e incubar a 45°C. Si se añade 1/10 del producto de la reacción de transcripción inversa a la PCR, la concentración de glicerol en la reacción de amplificación es del 0,4%, lo que no es suficiente para inhibir la PCR.

A menudo se añaden inhibidores de la ARNasa a las reacciones de transcripción inversa para aumentar la duración y el rendimiento de la síntesis de ADNc. Los inhibidores de la RNasa deben agregarse en la reacción de síntesis de la primera cadena en presencia de un tampón y un agente reductor (como DTT), porque el proceso previo a la síntesis del ADNc desnaturalizará el inhibidor, liberando así la RNasa unida que puede degradar el ARN. Los inhibidores de la proteína RNasa solo previenen la degradación del ARN por la RNasa A, B, C y no previenen la RNasa en la piel, por lo que a pesar de usar estos inhibidores, tenga cuidado de no introducir la RNasa con los dedos.

Utilizar transcriptasa inversa sin actividad RNaseH (RNaseH-): La transcriptasa inversa cataliza la conversión de ARN en ADNc Ya sea M-MLV o AMV, además de actividad polimerasa propia, tiene actividad RNasaH endógena. . La actividad RNasaH compite con la actividad polimerasa por la cadena híbrida formada entre el molde de ARN y el cebador de ADN o la cadena de extensión de ADNc, y degrada la cadena de ARN en el complejo ARN:ADN. La plantilla de ARN degradada por la actividad de la RNasaH ya no se puede utilizar como sustrato eficaz para la síntesis de ADNc, lo que reduce el rendimiento y la duración de la síntesis de ADNc. Por tanto, sería beneficioso eliminar o reducir en gran medida la actividad RNasaH de la transcriptasa inversa. La transcriptasa inversa RNaseH-MMLV y RNaseH-AMV pueden obtener más cantidades y longitudes más completas que MMLV y AMV. La sensibilidad de la RT-PCR se verá afectada por la cantidad de ADNc sintetizado. El tamaño de los productos de RT-PCR está limitado por la capacidad de la transcriptasa inversa para sintetizar ADNc, especialmente cuando se clonan ADNc más grandes.

La RNasaH-transcriptasa inversa puede aumentar significativamente el rendimiento de productos largos de RT-PCR y también aumenta la estabilidad térmica, por lo que la reacción se puede realizar a temperaturas superiores a los 37-42 °C normales.

2.7 Tratamiento con RNasaH

El uso de RNasaH para tratar la reacción de síntesis de ADNc antes de la PCR puede mejorar la sensibilidad. Para algunas plantillas, se cree que el ARN en la reacción de síntesis de ADNc previene la unión de los productos de amplificación, en cuyo caso el tratamiento con RNasaH puede aumentar la sensibilidad. Generalmente, el tratamiento con RNasaH es necesario cuando se amplifican plantillas diana de ADNc de longitud completa más largas, como las de bajo número de copias. Para esta plantilla difícil, el tratamiento con RNasaH mejoró la señal generada por el ADNc sintetizado por AMV. Para la mayoría de las reacciones de RT-PCR, el tratamiento con RNasaH es opcional porque el paso de desnaturalización de la PCR de incubación a 95 °C generalmente hidroliza el ARN en el complejo ARN:ADN.

2.8 Mejora de los métodos de detección de ARN en pequeñas cantidades

La RT-PCR es particularmente desafiante cuando solo hay una pequeña cantidad de ARN. La adición de glucógeno como portador durante el aislamiento del ARN ayuda a aumentar el rendimiento de pequeños volúmenes de muestra. El glucógeno libre de RNasa se puede añadir al mismo tiempo que Trizol. El glucógeno es soluble en agua y puede retenerse con el ARN en la fase acuosa para ayudar a la precipitación posterior. Para muestras de menos de 50 mg de tejido o 106 células cultivadas, la concentración recomendada de glucógeno libre de RNasa es de 250 μg/ml.

2.9 Comparación entre RT-PCR de un paso y de dos pasos

La RT-PCR de dos pasos es más común y más útil cuando se utiliza una muestra para detectar múltiples ARNm. Sin embargo, la RT-PCR de un solo paso tiene otras ventajas. La RT-PCR de un solo paso es fácil de operar cuando se procesan grandes cantidades de muestras y ayuda a reducir la contaminación residual porque no es necesario abrir las tapas de los tubos entre la síntesis y la amplificación del ADNc. El método de un solo paso puede lograr una mayor sensibilidad, tan baja como 0,1 pg de ARN total, porque se amplifica toda la muestra de ADNc. Para una RT-PCR de un solo paso exitosa, generalmente se utilizan cebadores específicos de genes antisentido para iniciar la síntesis de ADNc.

2.10 Aumentar la especificidad de la RT-PCR

Se pueden utilizar tres métodos diferentes para iniciar la síntesis de ADNc de primera cadena. La especificidad relativa de cada método afecta a la síntesis. Cantidad y tipo de ADNc. .

El método del cebador aleatorio es el menos específico de los tres métodos. Los cebadores se hibridan en múltiples sitios a lo largo del transcrito, produciendo ADNc corto y de longitud parcial. Este método se utiliza a menudo para obtener secuencias del extremo 5' y para obtener ADNc a partir de plantillas de ARN con regiones de estructura secundaria o con sitios de parada que no pueden replicarse mediante la transcriptasa inversa. Para obtener el ADNc más largo, es necesario determinar empíricamente la proporción de cebadores y ARN en cada muestra de ARN. La concentración inicial de cebadores aleatorios varía de 50 a 250 ng por 20 μl de reacción. Debido a que el ADNc sintetizado a partir de ARN total utilizando cebadores aleatorios es principalmente ARN ribosómico, generalmente se utiliza ARN poli(A) como plantilla.

Los cebadores oligo(dT) son más específicos que los cebadores aleatorios. Se hibrida con la cola poli(A) que se encuentra en el extremo 3' de la mayoría de los ARNm eucariotas. Debido a que el ARN poli(A) representa aproximadamente del 1 al 2% del ARN total, la cantidad y complejidad del ADNc es mucho menor que cuando se utilizan cebadores aleatorios. Debido a su alta especificidad, el oligo(dT) generalmente no requiere optimización de la proporción de ARN y cebador ni de selección de poli(A). Se recomienda utilizar 0,5 μg de oligo(dT) por 20 μl de sistema de reacción. oligo(dT)12-18 es adecuado para la mayoría de RT-PCR. El sistema ThermoScript RT-PCR proporciona oligo(dT)20 debido a su buena estabilidad térmica y es adecuado para temperaturas de incubación más altas.

Los cebadores específicos de genes (GSP) son los cebadores más específicos para el paso de transcripción inversa.

GSP es un oligonucleótido antisentido que puede hibridarse específicamente con la secuencia objetivo del ARN, a diferencia de los cebadores aleatorios u oligo(dT) que se hibridan con todo el ARN. Las mismas reglas utilizadas para diseñar cebadores de PCR se aplican al diseño de GSP para reacciones de transcripción inversa. El GSP puede ser de la misma secuencia que el cebador de amplificación que se hibrida con el extremo más 3' del ARNm, o el GSP puede diseñarse para hibridarse corriente abajo del cebador de amplificación inverso. Para algunos objetos amplificados, es necesario diseñar más de un cebador antisentido para que la RT-PCR tenga éxito porque la estructura secundaria del ARN diana puede impedir la unión del cebador. Se recomienda utilizar 1 pmol de GSP antisentido en 20 µl de la reacción de síntesis de la primera hebra.

2.11 Aumentar la temperatura de incubación de la transcripción inversa

Para aprovechar todas las ventajas de la especificidad de GSP, se debe utilizar la transcriptasa inversa con mayor estabilidad térmica. La transcriptasa inversa termoestable se puede incubar a temperaturas más altas para aumentar la rigurosidad de la reacción. Por ejemplo, si un GSP se hibrida a 55 °C, si se utiliza AMV o M-MLV para la transcripción inversa con un rigor bajo de 37 °C, la especificidad del GSP no se utilizará por completo. Sin embargo, algunas enzimas transcriptasas inversas especiales pueden reaccionar a 50 °C o más, lo que elimina los productos no específicos producidos a temperaturas más bajas. Para obtener la máxima especificidad, la mezcla de ARN/cebador se puede transferir directamente desde la temperatura de desnaturalización de 65 °C a la temperatura de incubación de transcripción inversa. Esto ayuda a prevenir el emparejamiento de bases intermoleculares a bajas temperaturas. Las múltiples conversiones de temperatura necesarias para la RT-PCR se pueden simplificar utilizando un instrumento de PCR.

2.12 Reducir la contaminación del ADN genómico

Una posible dificultad que encuentra la RT-PCR es la contaminación del ADN genómico en el ARN. El uso de un mejor método de aislamiento de ARN, como Trizol, reducirá la contaminación del ADN genómico en la preparación de ARN. Para evitar productos derivados del ADN genómico, el ARN se puede tratar con ADNasa I de grado de amplificación para eliminar el ADN contaminante antes de la transcripción inversa. Las muestras se incubaron en EDTA 2,0 mM a 65 °C durante 10 minutos para terminar la digestión con ADNasa I. El EDTA puede quelar iones de magnesio y prevenir la hidrólisis del ARN dependiente de magnesio que se produce a altas temperaturas.

Para separar el ADNc amplificado del producto de amplificación del ADN genómico contaminado, se pueden diseñar cebadores para aparearse con los exones separados respectivamente. Los productos de PCR derivados del ADNc serán más cortos que los derivados del ADN genómico contaminado. También se realizó un experimento de control sin transcripción inversa en cada plantilla de ARN para determinar si un fragmento determinado derivaba de ADN genómico o ADNc. El producto de la PCR obtenido sin transcripción inversa se deriva del genoma.