¿Cuáles son los procedimientos y precauciones experimentales del WB?

Los experimentos WB (Western Blot) se utilizan para detectar la expresión y cuantificación de proteínas. El principio básico es separar la proteína diana de la mezcla compleja y electroforizarla en un gel de poliacrilamida, transferir la proteína separada electroforéticamente a la membrana y detectar el nivel de expresión de la proteína diana mediante el reconocimiento de anticuerpos específicos. El siguiente es el procedimiento general y las precauciones para los experimentos de WB.

1. Preparación de la muestra

Primero, es necesario preparar una muestra, como una solución de ruptura celular o un homogeneizado de tejido. Las muestras deben almacenarse y manipularse en condiciones óptimas para evitar la inactivación y degradación de sus proteínas. Por lo general, la muestra se puede agregar al tampón de muestra SDS-PAGE y luego hervir, centrifugar, etc. para eliminar partículas residuales, burbujas de aire, etc.

2. Electroforesis SDS-PAGE

Añadir la muestra al pocillo de SDS-PAGE, normalmente utilizando un gel de gradiente 10-15 para la separación por electroforesis. Para evitar la agregación y coagulación de proteínas durante la electroforesis, es necesario agregar cantidades adecuadas de agentes oxidantes y reductores. Recuerde tener precaución para evitar la mezcla de agentes oxidantes y reductores o el contacto con la piel, los ojos y otros órganos durante los experimentos.

3. Transferencia de proteínas

Transferir las proteínas separadas por electroforesis a la membrana, generalmente utilizando membrana de PVDF o membrana NC. Durante el proceso de transferencia, se debe prestar atención al ajuste del conjunto de la membrana, el voltaje, el tiempo y otros parámetros para garantizar la eficiencia y precisión de la transferencia de proteínas. Una vez completada la transferencia, es necesario teñir y escanear la membrana para confirmar la transferencia de proteínas y la integridad de la membrana.

4. Identificación de anticuerpos específicos

Agregue anticuerpos específicos a la membrana, agregue anticuerpos primarios o anticuerpos múltiples según las necesidades experimentales y luego realice incubación, lavado y otros tratamientos. Los anticuerpos específicos pueden detectar los niveles de expresión de proteínas diana e identificar reacciones cruzadas con proteínas heterólogas. Cabe señalar que durante el proceso de incubación de anticuerpos, se deben controlar la temperatura y el tiempo para evitar la degradación y la reacción cruzada de los anticuerpos.

5. Cromatografía y cuantificación

Añadir el sustrato cromogénico ECL para estimular la actividad de la enzima en la membrana, y luego realizar la cromatografía y la obtención de imágenes de la proteína diana. Las señales de fondo, como el lavado con sulfito, deben eliminarse antes de obtener imágenes para garantizar la precisión de los resultados de la detección. Cuantificar el nivel de expresión de la proteína objetivo comparando la intensidad y el tamaño de la señal.

El experimento WB es una tecnología de investigación de proteínas altamente confiable y ampliamente utilizada. Durante el experimento, se debe prestar atención a las especificaciones operativas, el control de condiciones, el uso de reactivos y la seguridad para garantizar la confiabilidad y precisión de los resultados experimentales.