¿El kit de extracción de ARN contiene inhibidores de la RNasa?
Ingredientes del kit de extracción de ARN:
Pasos de la operación: Procesamiento de muestras:?
a.?Tejido vegetal: 100 mg fresco o congelado a -70° C El tejido se trituró en nitrógeno líquido y el polvo se añadió a 1 ml de solución de lisis y se mezcló.
b.Tejido animal: tomar 100 mg de tejido fresco o congelado a -70°C, añadir 1 ml de solución de lisis y homogeneizar con un mortero u homogeneizador.
c.Células adherentes: Añadir solución de lisis directamente a la placa de cultivo para lisar las células. Añadir 1ml de solución de lisis por cada 106 células. Utilice una muestra para mezclar uniformemente. ?
d.?Suspensión celular: Recoger las células mediante centrifugación. Añadir 1 ml de tampón de lisis por cada 106 células animales, vegetales y de levadura o cada 107 células bacterianas y mezclar bien.
e.? Procesamiento de sangre: tomar 0,2-1 ml de sangre fresca y agregar 3 veces el volumen de lisado de glóbulos rojos. Mezclar bien y colocar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Centrifugar a 10.000 rpm durante 1 minuto. . Deseche el sobrenadante si el sedimento contiene glóbulos rojos, agregue 2 veces el volumen de tampón de lisis de glóbulos rojos y repita el paso de lisis. Después de la centrifugación, añadir 1 ml de tampón de lisis al precipitado y mezclar bien.
2. Colocar la muestra procesada a temperatura ambiente durante 5 minutos para separar completamente los complejos ácido nucleico-proteína.
3. Añadir 0,2ml de cloroformo a la muestra homogeneizada, tapar el tubo, agitar vigorosamente durante 15 segundos y dejarlo a temperatura ambiente durante 3-5 minutos.
4. Centrifugar a 12000 rpm a 2-8 ℃ durante 10 minutos. El ARN se encuentra principalmente en la fase acuosa incolora superior. Transfiera la fase acuosa a un tubo nuevo y no absorba el precipitado.
5. Pretratamiento de la columna de adsorción: Añadir 500ul de solución de lavado de columna a la columna de adsorción, dejarla a temperatura ambiente durante 2 minutos, centrifugar a 12.000 rpm durante 2 minutos a 2-8°C y desechar los residuos. líquido.
6. Añadir 200ul de etanol absoluto al sobrenadante recogido en el paso 4 y mezclar bien, añadir a la columna de adsorción y dejar reposar durante 2 minutos, centrifugar a 2-8°C y 12000rpm durante 2 minutos, y deseche el líquido residual.
7. Agregue 600 ul de solución de enjuague a la columna de adsorción (verifique si se ha agregado etanol absoluto antes de usar), centrifugue a 12.000 rpm a 2-8 °C durante 2 minutos y deseche la solución residual. .
8. Añadir 600ul de solución de enjuague a la columna de adsorción, centrifugar a 12.000 rpm a 2-8°C durante 2 minutos y desechar el líquido residual.
9. Centrifugar a 12.000 rpm durante 2 minutos, desechar el tubo de recogida y colocar la columna de adsorción a temperatura ambiente durante unos minutos para eliminar el líquido de enjuague residual en la columna de adsorción.
10. Coloque la columna de adsorción en un tubo nuevo, deje caer 50-100ul de ?DDH2O libre de ARNasa en el centro de la membrana, déjela a temperatura ambiente durante 5 minutos y centrifugue a 12.000 rpm durante 2 minutos. minutos a temperatura ambiente para obtener ARN.
Notas:
1. Todos los utensilios y consumibles relacionados deben ser productos libres de RNasa. Tenga cuidado durante la operación y use máscaras y guantes para evitar contaminar las muestras con RNasa en el medio ambiente.
2. El valor de DO del ARN en solución acuosa puede estar entre 1,5 y 1,9, pero esto no significa que el ARN sea impuro y deba detectarse mediante electroforesis.