Cómo elegir el anticuerpo de citometría de flujo adecuado (5): ejemplos
1 Cómo hacer coincidir los marcadores fluorescentes de anticuerpos de citometría de flujo
La coincidencia de los marcadores fluorescentes de anticuerpos de citometría de flujo está determinada principalmente por tres. factores :Cuántos canales puede detectar el citómetro de flujo, cuántos indicadores deben detectarse simultáneamente y cuántos marcadores fluorescentes se incluyen en los anticuerpos del fabricante. Si el citómetro de flujo tiene más canales, se pueden generar más marcadores de superficie/intracelulares en la misma muestra al mismo tiempo.
Respuesta: ¿Cómo hacer coincidir los anticuerpos de citometría de flujo con la citometría de flujo?
1 ¿Citómetro de flujo BD (página 614, edición 06)
¿Cuántos canales tiene un flujo? Lo que el citómetro puede detectar viene determinado por el número de láseres y la función de cada láser, por lo que primero debemos prestar atención a dos puntos:
¿Qué láseres hay para el citómetro de flujo? Por ejemplo, el FACSCalibur estándar solo tiene un láser de 488 nm, que puede producir tres canales de fluorescencia/tres colores, FL1, FL2 y FL3. Sin embargo, el Calibur opcional. (abreviatura de FACSCalibur) está equipado con dos láseres, 488 nm y 635 nm, que pueden detectar cuatro canales/cuatro colores de FL1-FL4.
Los diferentes modelos de citómetros de flujo tienen diferentes capacidades para detectar fluoresceína en el mismo canal. Por ejemplo, ¿puede el FL3 (canal 3) de Calibur detectar PE-Texas? ¿rojo? PE-Cy5,? ¿PerCP? PerCPCy5.5, PE-Cy7 y el tercer canal de Aria solo pueden detectar PE-TexasRed. PE-Cy5,? PerCP.Calibur puede detectar PerCP-Cy5.5 en el tercer canal, que es la detección del cuarto canal en FACSAria. Calibur y LSR pueden detectar cuatro colores, pero el cuarto canal es diferente en la forma en que detecta la fluoresceína.
Principios de la coincidencia de fluoresceína
Hay dos principios para hacer coincidir la fluoresceína móvil: solo se puede seleccionar una fluoresceína para cada canal; la fluoresceína se puede combinar entre canales a voluntad, pero tenga cuidado.
1. Sólo se puede seleccionar 1 fluoresceína para cada canal. Tomando a Calibur como ejemplo, ¿el canal FL1 de Calibur no puede seleccionar AlexaFluro488 o Alexa? ¿Fluro488 no puede elegir FITC? ¿Puede el canal FL3 de Calibur detectar PE-Texas? ¿rojo? PE-Cy5,? ¿PerCP? ¿PerCP-Cy5.5? PE-Cy7 tiene cinco fluoróforos, pero solo podemos elegir 1 al hacer coincidir.
2. La fluoresceína en cada canal se puede combinar aleatoriamente: si el citómetro de flujo del cliente puede tener 4 canales, según el principio 1, entonces cada canal se puede seleccionar aleatoriamente para combinar 1 fluoresceína en 4 colores. Tomando como ejemplo el Calibur de 2 láseres, hay 16 combinaciones de fluoresceína en Calibur.
Por ejemplo, una combinación común es F? ¿I? t? c(?f?l?1?)+P? E(F?l?2)+PerCP(FL3)+APC(FL4),? ¿Puede Alex reemplazar esta combinación? fluoro(fl 1)+PE(FL2)+PerCP(FL3)+APC(FL4),? ¿O FITC(fl 1)+PE(FL2)+PERCP(FL3)+Alex? Fluro(FL4), o FITC(fl 1)+PE(FL2)+PE-CY5(FL3)+APC(FL4), etc. En resumen, bajo el principio de 1, podemos mezclar y combinar cada fluoróforo de forma arbitraria. Sin embargo, cabe señalar que si APC y PE-Cy5 se utilizan juntos, es fácil que se produzca una sobrecompensación después del flujo ascendente.
b.? ¿Cuántos fluoróforos hay en el anticuerpo BD?
1) La fluoresceína de cada anticuerpo proporcionado por el proveedor es diferente. Necesitamos hacer coincidir la fluoresceína de cada anticuerpo proporcionado por el proveedor al mismo tiempo. En principio, no hay diferencia en la aplicación entre diferentes números de clon de la misma etiqueta y 1-fluoresceína. Sin embargo, puede haber algunas diferencias sutiles entre algunos anticuerpos con diferentes números de clon. Es necesario leer las instrucciones con atención. Podemos intentar elegir anticuerpos con patrones de flujo en las instrucciones, o elegir anticuerpos con la mayor variedad de fluoresceínas.
2) Luciferina
Puedes iniciar sesión en www.bdbiosciences.com/spetra e ingresar la luciferina, el modelo de citómetro de flujo BD y la luz de excitación para encontrar la longitud de onda correspondiente.
¿Por qué recomendar a Alex? ¿Fluro488 y Alex? ¿Dónde está Fluro647?
Porque estas fluorescencias son muy brillantes, muy estables al láser, adecuadas para las características espectrales del citómetro de flujo, no sensibles al valor de pH y solubles en agua. Además, cuando se utilizan ambos juntos, el espectro de emisión es muy diferente y no requiere compensación.
C. ¿Qué debo hacer si el número de indicadores detectados supera los canales del citómetro de flujo?
Si es necesario medir cinco indicadores y el citómetro de flujo solo puede producir cuatro canales, primero divida los indicadores en dos categorías y luego divida la muestra en dos partes y detectelas por separado. Por ejemplo, si necesita detectar CD3, CD4, CD8, IL-4 e IFN-γ al mismo tiempo, divida la muestra en dos partes, agregue CD3, CD4, CD8 e IL-4 a la primera parte y agregue CD3, CD4, CD8 e IL-4 a la segunda parte.
2. Control de isotipo (¿isotipo? control)
1.
El control de isotipo utiliza inmunoglobulina de la misma especie, subtipo, dosis y subtipo como anticuerpo primario para eliminar la tinción de fondo causada por la unión no específica de los anticuerpos a las células. El control de isotipo es un verdadero control negativo, que no sólo puede usarse para establecer el voltaje del citómetro de flujo, sino que también ayuda a eliminar el costoso y tedioso paso de bloqueo competitivo de las citocinas recombinantes. Antes de la citometría de flujo, el método de tinción es el siguiente:
Tubo de ensayo de muestra: anticuerpo primario + muestra
Tubo de control de isotipo: control de isotipo + muestra.
2. ¿Cómo elegir el mismo tipo de controlador?
¿Se elige generalmente un anticuerpo con el mismo origen de especie, subtipo y subcadena, y la misma etiqueta fluorescente que el anticuerpo primario, como el CD56 antihumano? El anticuerpo marcado con APC, número de producto 555518, ¿el ingrediente es ratón? IgG1, κ Entonces, ¿su control de isotipo debería ser de ratones marcados con APC? IgG1, κ, el número de artículo es 555751. Tenga en cuenta que el control de isotipo se compone del mismo nombre que su nombre. Si la combinación de anticuerpos es un anticuerpo primario purificado + un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia, entonces se debe seleccionar un control de isotipo del anticuerpo primario. Por ejemplo, el anticuerpo purificado de CDw125, el número de producto es 555901, ¿el componente es de ratón? IgG1, κ. ¿Es su isotipo de ratón purificado? IgG1, κ, el número de artículo es 555746. Su anticuerpo secundario es IgG1 anti-ratón marcado con PE y el número de artículo es 550083. Entonces el método de tinción es el siguiente:
Tubo de muestra: ¿CD W25+PE purificado con etiqueta antirratón? Muestra de IgG 1+
Tubo de control de isotipo: ¿Control de isotipo purificado + anti-ratón etiquetado con PE? Muestra de IgG 1+
Si no se encuentra un control de isotipo adecuado, manteniendo la misma fuente, la misma etiqueta fluorescente y la misma clase de inmunoglobulina, el orden de prioridad debe ser diferentes subcadenas - diferentes subtipos - Misma categoría. Por ejemplo, ¿la fuente de un anticuerpo son los ratones? IgG2а, κ. Si no puede encontrar exactamente el mismo control de isotipo en la tabla de control de isotipo, primero seleccione un ratón con la misma etiqueta fluorescente. IgG2а es un producto de control de calidad de isotipos. ¿Qué debo hacer si no encuentro Mouse? IgG2а, ¿entonces elegir primero el ratón con la misma etiqueta fluorescente? Se utilizó IgG2b como control de isotipo. ¿Qué pasa si todavía no puedes encontrar el mouse? IgG2b, entonces ¿elegir un ratón con la misma etiqueta fluorescente? Se utilizó IgG2 como control de isotipo.
3. ¿Cómo encontrar controles del mismo tipo?
El control de isotipo es coherente con la posición de su anticuerpo de control en el catálogo en inglés de BD o en el sitio web de BD. En el catálogo de BD, el control de isotipos para anticuerpos antihumanos se encuentra al final del capítulo humano. El control de isotipo para anticuerpos anti-ratón está en la parte posterior del sello de rata, y el control de isotipo para anticuerpos de primates no humanos está en NON? ¿Humano? Después del capítulo de primates. Debido a que existen muy pocos anticuerpos contra ratas y la mayoría provienen de ratones, su control de isotipo es el mismo que el de ratones y se coloca después del capítulo de ratones. El control de isotipos de citocinas intracelulares, quimiocinas, complementos, mediadores inflamatorios y sus receptores se encuentra al final de sus capítulos (Nota: el control de isotipos de citocinas intracelulares en células humanas es diferente del control de isotipos de marcadores de superficie humanos). La misma comparación de tipo de Phosflow sigue a la introducción de Phosflow.
Por ejemplo, ¿CD56 antihumano? El anticuerpo marcado con APC, número de catálogo 555518, se encuentra en la página 169 de la edición de 2006 del catálogo de BD. ¿El ingrediente es rata? IgG1, κ. ¿Entonces su control de isotipo debería realizarse en humanos y ratones? ¿Inmunoglobulina? En la tabla Isotipo, página 191, ¿ratón marcado con APC? IgG1, κ, el número de artículo es 555751.
4. ¿Qué clientes necesitan utilizar el mismo tipo de controles?
¿Respuesta? Clientes que están menos familiarizados con la convección.
b? Ser un cliente de flujo intracelular, como citocinas, quimiocinas y proteínas de señalización intracelulares.
c? Los clientes que utilizan marcadores anormales o marcadores con baja especificidad, porque no están familiarizados con la expresión de marcadores anormales, pueden determinar la ubicación de las células positivas basándose en controles de isotipo. Algunos anticuerpos con baja especificidad, como los anticuerpos policlonales, tienen muchas uniones no específicas. El uso de controles de isotipo puede eliminar los falsos positivos.
d? Los clientes que están muy familiarizados con el proceso y utilizan marcas superficiales comunes generalmente no pueden utilizar el mismo tipo de control.
5.¿Por qué la expresión del control de isotipos es a veces mayor que la del anticuerpo?
Primero compruebe si se ha añadido el tipo y la dosis incorrectos del anticuerpo de control de calidad del isotipo. En segundo lugar, debido a que algunos marcadores no se expresan altamente en la superficie celular o dentro de las células, y hay muchos antígenos similares, cuando se agrega un control de isotipo, la unión no específica del control de isotipo excederá la especificidad del anticuerpo, lo que causa este fenómeno, como se muestra en el diagrama de superficie celular. En este momento se recomienda utilizar otros controles negativos, como controles en blanco.
En tercer lugar, microesferas de compensación
La compensación de fluorescencia del citómetro de flujo debe ajustarse a la posición adecuada después de un período de tiempo. Si la compensación de fluorescencia no se ajusta bien, la agrupación de células no será obvia o el gráfico de resultados obtenido por la detección de flujo será muy desagradable y los resultados de la detección se verán afectados. El ajuste de la compensación de fluorescencia es difícil de dominar para los principiantes, y el ajuste de la compensación también es una operación difícil en la citometría de flujo. Especialmente para la detección de algunos signos anormales, se requieren operadores de flujo muy experimentados para juzgar y ajustar la compensación en función de años de experiencia para obtener mejores datos e imágenes. Bueno, no hay necesidad de molestarse ahora. Porque las microesferas compensadoras lo hacen todo más fácil. ¿BD? CompBeads son microesferas de ajuste de compensación de fluorescencia que se utilizan especialmente para análisis multicolores en citometría de flujo. Su practicidad radica en superar las deficiencias de la dificultad en el ajuste de compensación y el alto consumo de muestra (a menudo usando un solo marcador de la muestra a probar para el ajuste de compensación) cuando se usan más de tres colores para el análisis de flujo. No tiene fluorescencia por sí solo y la compensación se ajusta incubándolo con el anticuerpo fluorescente específico del cliente. No sólo puede fijar y romper la membrana en las mismas condiciones experimentales que las células de muestra que se van a probar, sino que también tiene un funcionamiento sencillo, alta sensibilidad y buena consistencia, lo que hace que la compensación sea más fácil y precisa. Y lo más raro es que es más adecuado para análisis de varios colores (como cinco colores, seis colores, siete colores, etc.) y fluoresceína compuesta (como PE-Cy7, APC-Cy7, etc. ), porque la compensación en este momento suele ser difícil. Se pueden utilizar todo tipo de caudalímetros. Compbeads puede guardar las condiciones de flujo después de su uso para una fácil referencia al realizar la misma combinación de teñido fluorescente la próxima vez.