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Para permitir que la microscopía 4Pi acepte la excitación de un solo protón, se inventaron varias estrategias, como suprimir la fluorescencia de las hojas con emisión estimulada o emplear filtros de lentes especiales. Sin embargo, ninguno de estos métodos puede integrarse en los sistemas existentes. En este artículo, seguimos esta idea y requisitos previos específicos para resolver esta dificultad aumentando el ángulo de apertura sólida del sistema. Nuestro probado microscopio 4Pi es capaz de excitar un solo protón, produciendo imágenes 3D intracelulares confiables con una resolución axial de hasta 95 nm.

Como sugieren los nombres, tanto el microscopio 4Pi como el I5M se basan en frentes de onda circulares de gran ángulo. El ángulo de media apertura más grande hasta la fecha es de 68 grados, que se obtuvo con una lente de inmersión corregida con precisión. Los cálculos de PSF muestran que por cada aumento de 6 grados en el ángulo entre dos disparos opuestos, el PSF de la hoja disminuye en 7 PSF de intensidad (Figura I). Tipo C*** El PSF efectivo proporcionado por el microscopio 4Pi enfocado de excitación de protón único es:

heffr=hexc

4Pi -hdet

4Pi=Eexcr M ? EexcM ? r2 - Edetr

M ? Entre ellos, Eexc y Edet son el plano focal de excitación y el plano focal de detección respectivamente, M es la matriz de transformación que controla la superficie de la onda circular y pr representa el orificio. función.