Cómo diseñar cebadores de PCR que contengan sitios attB

El método de construcción de vectores utilizando tecnología de puerta de enlace de sitios múltiples Los pasos experimentales de puerta de enlace de sitios múltiples son los siguientes. Diseño de cebadores de PCR que contienen sitios attB. Se recomienda utilizar el software Vector NTI Advance para diseñar cebadores que contengan attB y attBr. El cebador aguas arriba debe cumplir las siguientes condiciones: Contiene 2225 pb de sitio attB Al menos 1825 pb de plantilla o secuencia específica de inserción Puerta de enlace de varios bits Especificidad de la secuencia del cebador Secuencias específicas de la figura Puerta de enlace de varios bits El cebador corriente abajo también debe cumplir las tres condiciones anteriores. Debido a que expresamos la proteína en E. coli, debemos agregar la secuencia SD Shine Dalgarno antes del sitio attB para garantizar una traducción precisa. Al mismo tiempo, para asegurar el marco de lectura correcto, necesitamos agregar dos nucleótidos antes del sitio attB, pero no se pueden agregar AA, AG y GA porque formarán un codón de terminación con el nucleótido T de timina al final de el hijo del sitio attB. Los procedimientos de PCR y los métodos de electroforesis fueron los mismos que los anteriores. Cabe señalar que si la plantilla de PCR es un plásmido que contiene un gen de resistencia a kanamicina, debe digerirse antes de la electroforesis y la purificación del producto de PCR. La enzima utilizada fue Dpn. El trabajo de la enzima es eliminar la plantilla para no interferir con reacciones posteriores. Sistema de digestión y proceso de digestión Agregue 5 μl de 10X REact Dpn37 a un sistema de reacción de PCR de 50 μl e incube durante 15 minutos 65 Choque térmico durante 15 minutos para obtener los productos que ingresan a la reacción de PCR. Excite durante 15 minutos y obtenga el clon de entrada de la reacción Dpn BP. El sistema de reacción es el siguiente. Lista de componentes cebadores de la reacción BP Componente de reacción muestra control negativo control positivo producto de PCR attB control positivo producto de PCR attB 20 50 fmoles pDONRTMvector 150 ng pMSGW. plásmido de control 100 ng TEBuffer pH que transporta La cantidad de producto de PCR en el sitio attB se puede calcular mediante la siguiente fórmula: 50 fmoles 2500 pb 660 fg fmoles ng106fg 82 Producto de PCR requerido Los pasos experimentales son los siguientes Calcular de acuerdo con los pasos anteriores, y agregue volúmenes apropiados de pDONRTMvector y producto de PCR al sistema de reacción. 20 Retire la mezcla de enzimas BP Clonase II del refrigerador y colóquela en una hielera para descongelarla durante dos minutos. Agite suavemente la solución de enzima BP dos veces durante dos segundos cada vez y regrésela inmediatamente al refrigerador. 20 Agite suavemente la muestra varias veces para convertirla en una mezcla homogénea. Incubar con proteinasa K37 durante 10 min a 25°C. Luego ingrese al paso de transformación y siga los mismos pasos para la construcción de vectores clásicos para obtener el clon de entrada que contiene el sitio attL. Tabla LR componente de reacción muestra control negativo attL4 clon attR1entry 10 fmoles clon attL4 attR1entry 10 fmoles clon attL1entry 10 fmoles clon attL1entry 10 fmoles clon attL2entry 10 fmoles clon attR2 attL3entry 10 fmoles pDEST R4 R3 vector II 20 fmoles TEBuffer pH método utilizado para construir rápidamente grandes cantidades de El método de fusión de vectores es un método que no depende de endonucleasas de restricción. Método de clonación independiente de enzimas de restricción Método de clonación independiente de enzimas de restricción La motivación original para introducir este método fue introducir fragmentos de ADN extraños en cualquier posición del vector.

Este método se basa en la amplificación de fragmentos de ADN.

Las grandes cantidades de ADN obtenidas pueden utilizarse como plantillas para la amplificación de vectores lineales. Este método puede lograr la inserción simultánea de múltiples genes extraños diferentes en cualquier posición de interés en un vector específico, compensando así la necesidad de sistemas de recombinación específicos de sitio en sitios específicos y sistemas especiales, proporcionando una base para la clonación molecular y la expresión de proteínas. La regulación proporciona una amplia gama de ideas y métodos. Este método se basa en la recombinación homóloga de fragmentos de ADN y ha sido ampliamente utilizado en el sistema In FusionTM proporcionado por Clontech.

Puede lograr los siguientes requisitos de clonación: clonación simultánea, reemplazo de genes, mutagénesis multisitio, Mutagénesis multisitio Clonación sincrónica, reemplazo de genes, mutagénesis multisitio, ensamblaje de múltiples componentes, inserción y eliminación simultánea de fragmentos de genes diana, diseño de cebadores y amplificación, el principio y los pasos de este método son los mismos que los anteriores en la PCR de fusión. método, pero en este método, el producto de PCR debe someterse a amplificación DTCP. En este método, el producto de la PCR se digiere con Dpn.

La linealización del vector se puede lograr mediante digestión específica o PCR tradicional. El método PCR se utiliza para linealizar el vector, lo que elimina la dependencia y restricciones en sitios de digestión específicos. Al mismo tiempo, logra completamente la conexión perfecta entre el vector y los fragmentos y elimina el impacto de la adición posterior de secuencias de bases especiales. los resultados experimentales y también proporciona Dahua 35 ahorra mucho tiempo y costos de inversión.

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La reacción de "ligadura" de fusión consiste en mezclar el fragmento de ADN purificado y el vector en un tubo 250EP en una proporción molar de 2,1 y añadir la enzima In fusionTM (proporcionada por Clontech Company) si es necesario) y tampón apropiado para llevar el volumen de reacción a 10 μl. Después de la digestión, las células se transfieren a células competentes y luego se analizan. En todo el proceso de construcción del vector de C. elegans, los materiales experimentales más importantes son diversas enzimas que promueven la reacción y células receptoras con alta eficiencia de transformación. Diferentes vectores requieren diferentes tipos de células receptoras, como DH5α, TOP10, etc., dependiendo de los genes de selección que portan o del huésped para la expresión específica. Por ejemplo, en reacciones de entrada multisitio, a menudo se requiere un mecanismo de detección de ccdB, en cuyo caso no se pueden utilizar cepas que portan el gen ccdA, como TOP10F'.

Por lo tanto, el tipo de célula receptora debe utilizarse de forma selectiva a la hora de construir diferentes métodos. A continuación se toma como ejemplo la célula receptora DH5α comúnmente utilizada en el laboratorio para presentar el proceso de preparación del método CaCl2. El principio del método CaCl2 es tratar bacterias de rápido crecimiento con una solución hipotónica de CaCl2 a baja temperatura para obtener una cepa esférica de células receptoras. Esta morfología facilita la formación de moléculas de ADN exógenas en complejos de hidroxilo-fosfato cálcico resistentes a la ADNasa. Este complejo se adherirá a la superficie de la bacteria. Si se estimula con calor, la absorción de ADN por parte de la célula mejorará enormemente. La clave del experimento es seleccionar una cepa en la fase de crecimiento logarítmico, y todas las operaciones deben llevarse a cabo en condiciones lo más libres de contaminación, impurezas y bajas temperaturas posible.

Materiales experimentales y preparaciones El método de preparación de 100 ml de triptona CaCl2 es: pesar 22 CaCl2 y añadir 200 ml de agua esterilizada, disolver completamente y conservar en nevera a 4 grados centígrados.

La glicerina a una concentración de 100 a 120 se esteriliza a altas temperaturas. Equipo: Es necesario esterilizar una pipeta de 10 ml. Es necesario esterilizar una placa de Petri de vidrio revestida con papel de filtro. Es necesario esterilizar una caja de puntas grandes, medianas y pequeñas. Un tubo de centrífuga de 50 ml es necesario esterilizarlo en un recipiente de metal. Es necesario esterilizar una caja de 100 ml de medio de cultivo SOB. Los pasos para 40 tubos EP son los siguientes: 80. Saque el DH5α del refrigerador, congélelo y descongélelo a temperatura ambiente e inocule las bacterias en una placa de Petri antirresistente a través de una. bucle de inoculación. Coloque la placa de Petri en 3. Coloque el tubo de centrífuga de 15 ml preesterilizado en el baño de agua de la mesa de trabajo ultralimpia y expóngalo a la radiación UV durante más de media hora.

Elija una colonia de la placa de Petri, inocúlela en un tubo de centrífuga, luego introdúzcala en 3 ml de medio antibiótico agitador LB 37 y cultívela durante la noche a 300 rpm. Al día siguiente, se inoculó 1 ml de la colonia en 100 ml de medio LB y se incubó a 215 rpm durante 2 a 3 h. Durante este período, el valor de DO a una longitud de onda de 600 nm debe medirse cada media hora. Detener el cultivo y colocar el matraz en hielo durante 10 a 15 minutos. Mientras tanto, coloque los tubos de centrífuga preesterilizados de 50 ml en hielo para que se enfríen a 0 °C. En una mesa laminar, dividir el líquido lo más uniformemente posible en dos tubos de centrífuga de 50 ml y centrifugar a 4000 rpm durante 10 minutos. Desechar el sobrenadante, invertir el tubo de centrífuga sobre el papel de filtro durante 1 minuto y aspirar el medio de cultivo restante. Resuspender los organismos agregando 5 ml de solución de CaCl2 0,1 M preenfriada a cada tubo y comenzar a cronometrar durante 30 minutos soplando suave y repetidamente con una pipeta. La suspensión se centrifugó nuevamente a 4000 rpm durante 5 min, se eliminó el sobrenadante, se drenó el medio de cultivo residual y se agregaron a cada tubo 2 ml de solución de CaCl2 0,1 M preenfriada y se repitió el proceso de aireación para resuspender las bacterias. . En este punto, los dos tubos se pueden combinar en un solo tubo y enfriar previamente en hielo durante 20 minutos, tiempo durante el cual el tubo EP esterilizado de 1 ml se puede enfriar previamente en hielo. Agregue 500 µl de glicerol y 100 ml de EP al tubo de ensayo. Una vez que se hayan dividido en alícuotas todos los tubos, colóquelos en nitrógeno líquido durante 1 hora y luego transfiéralo a un congelador a 80ºC. Se utilizaron controles positivos para evaluar la eficiencia de la transformación bacteriana. Se utilizan controles negativos para descartar la posibilidad de contaminación de las células receptoras e identificar posibles factores de falla. Se utilizan controles negativos para descartar la posibilidad de contaminación de las células receptoras e identificar posibles factores de falla. Los controles negativos se utilizan para colocar en placas sólo células susceptibles sin ADN en una placa que contiene un antígeno específico. Control positivo Seleccione un plásmido estándar (normalmente pUC19) y transfórmelo en células competentes a una concentración de 50 o 100 pg. Coloque la placa en una incubadora a 37°C durante la noche. Cuente el número de colonias individuales para estimar la eficiencia de transformación de las células competentes.

La fórmula para estimar la eficiencia es la tasa de transformación 1000 clones 10 pg de ADN. Cuando el valor alcanza 1.106, se puede utilizar para experimentos de clonación generales. Cuando el valor alcanza 1.107, se puede utilizar para construir más complejos. clones. Microinyección de nematodos Al microinyectar genes exógenos en las gónadas de nematodos hermafroditas, se pueden obtener fragmentos de ADN de nematodos de tipo de línea específicos y pasarlos a la siguiente generación mediante integración homóloga y no homóloga entre cromosomas. Los pasos para la microinyección son los siguientes: Hacer una almohadilla. Colocar la agarosa No. 2 preparada en un baño de agua para evitar la coagulación. Pipetee 100 µl en un portaobjetos limpio y presione rápidamente otro portaobjetos sobre él. Retire el portaobjetos después de que la agarosa se haya secado ligeramente. Marque la parte delantera y trasera de la almohadilla de agarosa y colóquela en un desecador a 80° durante la noche.

Los electrodos extensibles se utilizan habitualmente como electrodos de inyección, utilizándose microelectrodos de vidrio de borosilicato con un núcleo interior de diámetro exterior de 1 nm y diámetro interior de 0,75 nm. La punta del electrodo extraída por el tensor está cerrada y es necesario abrir una abertura del tamaño adecuado antes de su uso.

Preparación de la solución inyectable: Generalmente, se selecciona un plásmido vector de 10 propósitos para el sistema de inyección, con un rango de concentración de 110 μl. El volumen restante se niveló con 1 TE. Centrifugar a 12 000 rpm durante 3 min. Pipetee 1 μl de la solución de inyección en el electrodo estirado y déjelo reposar durante 1520 minutos para permitir que la solución de inyección se sifone a través del núcleo interno hasta la parte superior del electrodo y elimine las burbujas de aire internas. Saque la almohadilla para la inyección y ponga una gota de aceite sobre ella, asegurándose de que sea suficiente para ralentizar el proceso de secado de los nematodos, pero no tanto como para que los nematodos se muevan. Elija los nematodos N2 adultos tocando la parte superior del aceite con una aguja limpia. El área donde se recolectan los nematodos debe ubicarse lejos de la ubicación del parche para evitar que las colonias caigan sobre la alfombra. También es importante seleccionar nematodos con gónadas fácilmente identificables.

Coloque el nematodo verticalmente sobre la alfombra con sus gónadas en el lado izquierdo. Normalmente, la vulva del nematodo apuntará en la dirección de la aguja y las gónadas de ambos lados corresponderán directamente a la pared del cuerpo. Coloque el nematodo en un ángulo de 15 a 45 grados con respecto a la aguja y baje suavemente la aguja para que quede al nivel del nematodo. Cambie a la lente de 40 objetivos. Apunte la lente al citoplasma de la gónada. Utilice la perilla de ajuste para mover la aguja hacia arriba y hacia abajo hasta que la punta de la aguja esté alineada con el citoplasma de la gónada. Mueva suavemente el nematodo a lo largo de la aguja. Mientras se inserta la aguja en el nematodo, presione suavemente el gusano para que sus gónadas queden opuestas a la pared celular. Gire suavemente la perilla para comenzar a inyectar la inyección de ADN. Abra y cierre rápidamente la perilla. Si la aguja está firmemente adherida a la gónada del nematodo, el área se hinchará y se llenará de líquido. Si el líquido no fluye suavemente, tocar ligeramente la mesa ayudará a resolver el problema. Es importante evitar agregar demasiado líquido para que no se propague a otras partes del nematodo a lo largo del sitio de entrada de la aguja. Se recomienda retirar la aguja del gusano en sentido antihorario. Volver al objetivo 10. Suspender los nematodos con una gota de tampón M9. Utilice un palillo para cejas para colocar los nematodos en otra placa que contenga tampón M9. Esto se hace para eliminar el exceso de aceite. Luego, los nematodos se recogen y se colocan en un plato que contiene bacterias. Se pueden colocar múltiples nematodos inyectados en una sola placa.

Después de dos o tres días, cuente los nematodos transgénicos F1 y transfiera los nematodos refractados con éxito individualmente a la placa para obtener nematodos con una línea germinal transgénica estable. Microinyección de gónadas de nematodos Gónadas de nematodos 3910 Posibles problemas y contramedidas Los nematodos se rompen o mueren después de la inyección La razón puede ser que la aguja es demasiado grande o los nematodos mueren por falta de agua. El método puede ser reemplazar cada gónada de nematodo con un nuevo nematodo. gónada. Si la estación de nematodos no aparece, la razón puede ser que la almohadilla sea demasiado delgada o que la aguja no esté seca. Si las lombrices se secan demasiado rápido, use una estera más delgada o transfiera las lombrices a un plato más húmedo antes de la inyección. El método de construcción de los plásmidos utilizados en los experimentos se ha descrito detalladamente en la sección "Introducción y Métodos". La información sobre los promotores de genes, como el tamaño del promotor, los sitios de expresión, etc., se obtuvo con la ayuda de la literatura interceptando secuencias de ADN de longitudes específicas en Wormbase, buscando las secuencias ascendentes y descendentes del gen en NCBI, y con la ayuda de UCSC La página web proporciona información de secuencia para buscar la dirección del gen. Obtuvimos la secuencia del promotor utilizando la información de secuencia proporcionada en el sitio web de UCSC. Sin embargo, al diseñar cebadores promotores, es importante tener en cuenta que los extremos 3' y 5' de la secuencia se pueden ajustar en pequeña medida en función de la coincidencia de los cebadores. Todavía hay algunas neuronas cuyas ubicaciones no se pueden determinar de manera concluyente debido a la falta de promotores con perfiles de expresión exactos.

El gusano tiene 302 neuronas y etiquetarlas requiere mucho trabajo de construcción de plásmidos. Comenzamos nuestros experimentos realizando reacciones de BP utilizando métodos de ligadura enzimática tradicionales y modificamos vectores de C. elegans de uso común para lograr este objetivo. Sin embargo, a medida que el proyecto se desarrolló y el método mejoró, descubrimos que el método de entrada multisitio era más conveniente y eficiente, especialmente después de comprar bibliotecas de promotores de nematodos masculinos y femeninos. Esta técnica se puede utilizar no sólo para etiquetar neuronas sino también para construir experimentos de rescate y detectar señales de calcio. Al mismo tiempo, para tener un sistema completo para todo el proyecto, dedicamos mucho esfuerzo a modificar las construcciones menos estandarizadas obtenidas previamente de la reacción de puerta de enlace para obtener un sistema de expresión universal. El vector pDESTR4 R3 en la puerta de enlace multisitio se modificó a pPD49 26 R4 R3. En el proceso de construcción de vectores policlonales utilizando tecnología de puerta de enlace multisitio, descubrimos que este sistema no es perfecto debido a la Las secuencias de los sitios de recombinación son algo similares, y las secuencias de los fragmentos a insertar en el vector, especialmente las secuencias de los cebadores, no son perfectas.

Debido a las diferentes secuencias de los sitios de recombinación en En este sistema, las secuencias de los fragmentos tampoco son perfectas. Por lo tanto, si la secuencia del fragmento que se intenta insertar en el vector, especialmente la secuencia del fragmento que coincide con el cebador, es similar al sitio de recombinación, provocará que la reacción involucrada en esta tecnología falle.

Al mismo tiempo, cuando queremos usar un promotor para impulsar la expresión de más de dos genes, no podemos usar simplemente pDESTR4R3 en el kit de Invitrogen, porque cuando se expresan genes extraños en nematodos, se necesita 3'UTR para estabilizar todo el gen. proceso de traducción. El vector en el kit de Invitrogen no contiene la 3'UTR que necesitamos. Por lo tanto, mejoramos un nuevo vector para la reacción LR, concretamente pPD49 26 R4R3, porque pPD49 26 contiene la 3'UTR de unc54, y demostramos a través de la reacción de puerta de enlace multisitio que nuestro vector mejorado también tiene una eficiencia de respuesta muy alta. pPD49 26 R4 R3 La eficacia de Pgpa 4 en el etiquetado específico de neuronas ASI puede impulsar la expresión de TagRFP t en esta neurona. Esta es una comparación del posicionamiento de campo claro y fluorescencia. pPD4926 R4 R3 LRreaction multisitegateway ASI puede convertir el promotor attL1 attL2 en el promotor attL4 attR1 Clon del adaptador de validación Como se mencionó anteriormente, llevaremos attB1 Como se mencionó anteriormente, hemos modificado el promotor que lleva el sitio attB1 attB2 para obtener un multisitio estándar. El primer clon de entrada en el punto de reacción de la puerta de enlace, durante este proceso de modificación, necesitamos introducir un reactivo intermedio, es decir, el clon del adaptador. Si podemos observar que el promotor modificado es capaz de impulsar la expresión de la proteína fluorescente en un sitio específico, podemos verificar la eficacia del clon adaptador. En este estudio, utilizamos promotores modificados para impulsar la expresión de proteínas fluorescentes en sitios específicos. En este estudio, verificamos la efectividad de la clonación del adaptador mediante la utilización del promotor modificado Pdaf 7 para impulsar la expresión de proteínas fluorescentes en ASI neuronal.