Diseño experimental: eliminar sitios de restricción en vectores de ADN circulares

Los vectores de ADN circular son plásmidos o cósmidos. .

Si compra un vector comercial, eliminar el sitio de escisión de la enzima en la sección con múltiples sitios de escisión de la enzima no inactivará la proteína expresada por el gen objetivo. Sin embargo, si no está en el múltiple. sitio de corte de la enzima, otras "estructuras" pueden verse afectadas, como la falla de la resistencia amp o la resistencia clo (impacto fatal en la detección posterior), etc.

Si hay múltiples sitios de corte de enzimas, los sitios de corte de enzimas en esta región no se pueden eliminar mediante un doble corte de enzimas, por lo que se recomienda diseñar cebadores de PCR razonables para esta operación de eliminación, que es similar a Mutagénesis dirigida al sitio El principio es similar, por lo que solo es necesario diseñar un cebador. Sin embargo, el kit es relativamente caro, alrededor de 20.000 yuanes (20 reacciones), y el diseño del cebador adicional y la secuenciación posterior cuestan alrededor de 2.500 yuanes.

Principio:

De hecho, es el principio de la reacción PCR:

La replicación semiconservativa del ADN es una forma importante de evolución y generación biológica. . El ADN de doble cadena se puede desnaturalizar y fundir en cadenas simples bajo la acción de varias enzimas. Con la participación de la ADN polimerasa y el promotor, se copia en dos moléculas idénticas según el principio de apareamiento de bases complementarias. En experimentos, se descubrió que el ADN también puede desnaturalizarse y fundirse a altas temperaturas, y puede renaturalizarse en dobles hebras cuando se reduce la temperatura. Por lo tanto, al controlar la desnaturalización y renaturalización del ADN mediante cambios de temperatura, diseñar cebadores como promotores y agregar ADN polimerasa y dNTP, se puede completar la replicación in vitro de genes específicos. El efecto de cambiar genes se logra mediante el diseño de cebadores específicos.

/lemma-php/dispose/view.php/2764.htm

/lemma-php/dispose/view.php/274624.htm

Específico Por favor envíeme un manual de instrucciones por correo electrónico a mi dirección de correo electrónico.

Equipo experimental:

Instrumento de PCR (utilizado para la reacción de PCR), baño de agua (que digiere el ADN plasmídico no mutado), equipo de serie de cultivo de cepas, consumibles experimentales y reactivos.

Pasos:

Diseñar cebadores——》Enviar a una empresa bioquímica para sintetizar cebadores——》PCR——》Digerir ADN no mutado——》Seleccionar bacteria huésped——》Competente altamente eficiente estado Preparar o comprar -> Transformación -> amp u otro recubrimiento de placa resistente -> Cultivo -> Extracción de plásmido de colonia única -> Detección -> Confirmación de secuenciación -> Obtener el ADN objetivo.

＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝=====

Si quieres saber más sobre it, puedes seguirme por email me comunico.