¿Qué es el inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) de inmunoglobulina G1 (IgG1) de ratón? ¿Para qué se utiliza?

Principio experimental:

Este kit utiliza el método sándwich de doble anticuerpo para determinar el nivel de inmunoglobulina G1 (IgG1) de ratón en la muestra. El anticuerpo IgG1 de ratón purificado se utiliza para recubrir la placa de micropocillos para producir un anticuerpo en fase sólida. Se agrega secuencialmente inmunoglobulina G1 (IgG1) a los micropocillos recubiertos con el anticuerpo monoclonal y luego se combina con el anticuerpo IgG1 marcado con HRP para formar un anticuerpo. anticuerpo-antígeno. -El complejo de anticuerpo marcado con enzima se lava minuciosamente y luego se añade el sustrato TMB para el desarrollo del color. El TMB se convierte en azul bajo la catálisis de la enzima HRP y en el amarillo final bajo la acción del ácido. La profundidad del color se correlaciona positivamente con la inmunoglobulina G1 (IgG1) en la muestra. Utilice un lector de microplacas para medir la absorbancia (valor OD) a una longitud de onda de 450 nm y calcule la concentración de inmunoglobulina G1 de ratón (IgG1) en la muestra a través de la curva estándar.

Composición del kit:

Composición del kit

Configuración de 48 pocillos

Configuración de 96 pocillos

Guardar

Instrucciones

1 copia

1 copia

Película de sellado

2 piezas (48)

2 piezas (96)

Bolsa sellada

1 pieza

1 pieza

Placa recubierta con etiqueta enzimática

1×48

1×96

Almacenado a 2-8℃

Estándar: 360μg/ml

0,5 ml 1 botella

1,5 ml × 1 botella

Almacenado a 2-8 ℃

Reactivo de etiquetado enzimático

3 ml × 1 botella

6 ml×1 botella

Ahorre a 2-8 ℃

Diluyente de muestra

3 ml×1 botella

6 ml×1 botella

Ahorrar a 2-8℃

Solución de revelador A

3 ml×1 botella

6 ml×1 botella

Almacenado a 2-8 ℃

Solución de revelador B

3 ml×1 botella

6 ml× 1 botella

Ahorre a 2-8 ℃

Solución de parada

3 ml×1 botella

6 ml×1 botella

Ahorrar a 2-8℃

Solución de lavado concentrada

(20ml×20 veces)×1 botella

(20ml×30 veces )×1 botella

Guardar a 2-8°C

Procesamiento y requisitos de la muestra:

1 Suero: la sangre se coagulará naturalmente a temperatura ambiente durante 10. -20 minutos, centrifugar durante unos 20 minutos (2000- 3000 rpm). Recoger el sobrenadante con cuidado. Si se produce precipitación durante el almacenamiento, centrifugar nuevamente.

2. Plasma: Se debe seleccionar EDTA, citrato de sodio o heparina como anticoagulante de acuerdo con los requisitos de la muestra. Después de mezclar durante 10 a 20 minutos, centrifugar durante aproximadamente 20 minutos (2000-3000 rpm). . Recoger el sobrenadante con cuidado. Si se forma algún precipitado durante el almacenamiento, se debe centrifugar nuevamente.

3. Orina: Recoger en un tubo estéril y centrifugar durante unos 20 minutos (2000-3000 rpm). Recoger el sobrenadante con cuidado. Si se forma algún precipitado durante el almacenamiento, centrifugar nuevamente. Se realizan como referencia torácica, ascitis y líquido cefalorraquídeo.

4. Sobrenadante del cultivo celular: Al detectar componentes secretados, recogerlo en un tubo estéril. Centrifugar durante unos 20 minutos (2000-3000 rpm). Recoger con cuidado el sobrenadante. Al detectar componentes intracelulares, diluya la suspensión celular con PBS (PH7.2-7.4) hasta que la concentración celular alcance aproximadamente 1 millón/ml. Al congelar y descongelar repetidamente, las células se destruyen y se liberan componentes intracelulares. Centrifugar durante unos 20 minutos (2000-3000 rpm). Recoger con cuidado el sobrenadante.

Si se forma precipitado durante el almacenamiento, centrifugue nuevamente.

5. Muestra de tejido: Después de cortar la muestra, pesarla. Añadir una cierta cantidad de PBS, pH 7,4. Congele rápidamente y almacene en nitrógeno líquido para su uso posterior. La muestra aún mantiene una temperatura de 2-8°C después de descongelarse. Añadir una cierta cantidad de PBS (PH7,4) y homogeneizar la muestra completamente a mano o con un homogeneizador. Centrifugar durante unos 20 minutos (2000-3000 rpm). Recoger con cuidado el sobrenadante. Después del envasado, se probará una porción y el resto se congelará para su uso posterior.

6. Las muestras deben extraerse lo antes posible después de la recolección. La extracción debe realizarse de acuerdo con la literatura relevante. El experimento debe realizarse lo antes posible después de la extracción. Si la prueba no se puede realizar inmediatamente, la muestra se puede almacenar a -20 °C, pero se debe evitar la congelación y descongelación repetidas.

7. Las muestras que contienen NaN3 no se pueden analizar porque el NaN3 inhibe la peroxidasa de rábano picante (HRP). ) actividad.

Pasos de la operación

1. Dilución y adición de sustancia estándar: coloque 10 pocillos de sustancia estándar en la placa recubierta con enzima marcada y agregue 10 pocillos de sustancia estándar en el primero y el otro. segundos pocillos, respectivamente, 100 µl de estándar, luego agregue 50 µl de diluyente estándar en el primer y segundo pocillos, y mezcle bien, luego tome 100 µl de cada uno de los primeros y segundos pocillos y agréguelos al tercer y cuarto pocillos respectivamente, y luego agregue 3. Agregue 50 μl de diluyente estándar al cuarto pocillo y mezcle bien, luego, primero tome 50 μl de cada uno de los pocillos tercero y cuarto y deséchelos, luego tome 50 μl de cada uno y agregue a los pocillos quinto y sexto; respectivamente, y luego agregue 50 µl de cada uno a los pocillos quinto y sexto, y luego agregue, agregue 50 µl de diluyente estándar al sexto pocillo y mezcle bien después de mezclar, tome 50 µl de cada uno de los pocillos quinto y sexto, agréguelo; a los pocillos séptimo y octavo, y luego agregue Agregue 50 µl de diluyente estándar respectivamente, mezcle bien y agregue 50 µl de los pocillos séptimo y octavo a los pocillos noveno y décimo, luego agregue 50 µl de diluyente estándar al noveno y décimo pocillos respectivamente y mezclar bien. Desechar 50 l de cada uno de los pocillos noveno y décimo. (Después de la dilución, el volumen de muestra en cada pocillo es de 50 µl y las concentraciones son 240 µg/ml, 160 µg/ml, 80 µg/ml, 40 µg/ml y 20 µg/ml respectivamente).

2. Agregue muestras: configure los pocillos en blanco (no se agregan muestras ni reactivos marcados con enzimas a los pocillos de control en blanco, y los pasos restantes son los mismos) y los pocillos de muestra que se van a analizar. Primero agregue 40 l de diluyente de muestra al pocillo de la muestra que se va a analizar en la placa recubierta con enzima marcada y luego agregue 10 l de la muestra a analizar (la dilución final de la muestra es 5 veces). Agregue la muestra al fondo del pocillo de la placa de enzimas, trate de no tocar la pared del pocillo y agite suavemente para mezclar.

3. Incubación: Sellar la placa con film sellador e incubar a 37°C durante 30 minutos.

4. Preparación de la solución: Diluir 30 veces (20 veces de 48T) el líquido de lavado concentrado con agua destilada 30 veces (20 veces de 48T) y reservar.

5. Lavado: Retire con cuidado la película selladora, deseche el líquido, centrifugue, llene cada pocillo con líquido de lavado, déjelo reposar durante 30 segundos y deséchelo, repita esto 5 veces y seque.

6. Añadir enzima: Añadir 50 μl de reactivo de marcado enzimático a cada pocillo, excepto a los pocillos en blanco.

7. Incubación: La operación es la misma que la 3.

8. Lavado: El funcionamiento es el mismo que el paso 5.

9. Desarrollo del color: primero agregue 50 μl de cromógeno A a cada pocillo, luego agregue 50 μl de cromógeno B, agite suavemente para mezclar y desarrolle el color durante 15 minutos a 37 °C en la oscuridad. p>

10. Terminación: Agregue 50 μl de solución de parada a cada pocillo para finalizar la reacción (el azul se vuelve amarillo inmediatamente).

11. Medición: Mida la absorbancia (valor OD) de cada pocillo secuencialmente con un aire acondicionado cero y una longitud de onda de 450 nm. La medición debe realizarse dentro de los 15 minutos posteriores a la adición de la solución de parada.

Notas:

1. El kit debe sacarse del ambiente refrigerado y dejarse equilibrar a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos antes de su uso. Si la placa recubierta con la etiqueta enzimática no se agota después de abrirla, las tiras deben almacenarse en una bolsa sellada.

2． El líquido de lavado concentrado puede tener cristales precipitados. Al diluirlo, se puede calentar en un baño de agua para ayudar a que se disuelva. El resultado no se verá afectado durante el lavado.

3． Se debe utilizar un inyector de muestra para cada paso de la adición de muestra y se debe verificar su precisión con frecuencia para evitar errores experimentales. Es mejor controlar el tiempo de adición de la muestra en 5 minutos. Si hay una gran cantidad de muestras, se recomienda utilizar una pistola de volea para agregar muestras.

4． Haga una curva estándar al mismo tiempo cada vez que mida. Lo mejor es hacer agujeros duplicados. Si el contenido de la sustancia que se va a medir en la muestra es demasiado alto (el valor de DO de la muestra es mayor que el valor de DO del primer pocillo del pocillo estándar), dilúyalo un cierto múltiplo (n veces) con el Diluyente de muestra antes de medir. Al calcular, multiplique por la dilución total. Múltiple (×n×5).

5． La película selladora es para un solo uso para evitar la contaminación cruzada.

6. Guarde el sustrato lejos de la luz.

7. Siga estrictamente las instrucciones y los resultados de la prueba deben determinarse en función de las lecturas del lector de microplacas.

8. Todas las muestras, soluciones de lavado y diversos desechos deben tratarse como agentes infecciosos.

9. No se deben mezclar componentes de diferentes números de lote de este reactivo.

10. Si hay alguna discrepancia con el manual de instrucciones en inglés, prevalecerá el manual de instrucciones en inglés.