PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real

La PCR cuantitativa por fluorescencia en tiempo real, denominada RT-QPCR, es un tipo de Q-PCR. Actualmente, esta tecnología se ha utilizado ampliamente, como por ejemplo: análisis de especificidad de amplificación, análisis cuantitativo de genes, genotipado. , Análisis SNP, etc. El método comúnmente utilizado para la PCR cuantitativa de fluorescencia es el método no específico del colorante de unión al ADN SYBR GreenⅠ.

SYBR Green I es un tinte fluorescente con una longitud de onda de excitación verde que se une a la región del surco menor de todas las dobles hélices de ADNds y puede unirse a todas las moléculas de ADN bicatenario de diversas secuencias. En estado libre, SYBR Green I emite una fluorescencia débil, pero una vez que se combina con ADN bicatenario y se incrusta en ADNds, la fluorescencia aumenta considerablemente.

Por lo tanto, la intensidad de la señal de fluorescencia de SYBR Green I está relacionada con la cantidad de ADN bicatenario. En diferentes etapas de amplificación por PCR, el contenido de dsDNA es diferente y la intensidad de la señal de fluorescencia de SYBR Green I es. diferente. La cantidad de ADN bicatenario presente en el sistema de PCR se puede detectar en función de la señal de fluorescencia y se pueden realizar cálculos y análisis relevantes en función del control.

Antes de comenzar el experimento, es necesario preparar varios reactivos y consumibles necesarios para el experimento.

Los reactivos incluyen: cebadores específicos para PCR, ARN total recién extraído para su uso posterior.

Los kits utilizados son: Kit Roche para la síntesis de ADNc de primera cadena Transcriptor FirstStrand cDNA Synthesis Kit, que contiene todos los componentes experimentales necesarios para la reacción de ADNc y los componentes relacionados de la reacción de control positivo.

El kit utilizado con LightCycler? 480, LightCycler? 480 SYBR Green I Master, contiene varios componentes experimentales necesarios para la PCR. Por ejemplo, el tubo 1 contiene mezcla de ADN polimerasa Taq de arranque en caliente. , tinte SYBR Green I y MgCl2 Antes de comenzar la prueba formal, descongele cada reactivo y los componentes del kit en hielo y colóquelos en hielo hasta su uso. Nota: SYBR Green I Master debe colocarse lejos de la luz.

Los instrumentos y consumibles necesarios incluyen: Roche LightCycler? 480, instrumento de PCR cuantitativa en tiempo real totalmente automático y compatible con placas multipocillos de 96 o 384, películas de sellado transparentes y otros consumibles desechables. Instrumento de PCR Thermo Scientific Arktik, pipeta de un solo canal, caja de hielo Nunc y puntas en caja QSP, etc. proporcionados por Thermo Fisher Scientific.

A continuación, ingrese a la parte experimental. El proceso operativo de este experimento es: primero use ARN recién extraído para realizar una transcripción inversa para sintetizar la primera hebra de ADNc y luego realice una PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real, que incluye: Configuración del sistema de reacción SYBR Green; configuración del programa de PCR; ejecución de experimentos de PCR, edición de muestras y análisis de resultados.

Primero, la primera hebra de ADNc se sintetiza mediante transcripción inversa:

Nota durante las operaciones experimentales: use guantes durante todas las operaciones relacionadas con el ARN para evitar la contaminación con ARNasa. Las operaciones pertinentes deben realizarse estrictamente de acuerdo con las instrucciones de uso del kit.

De acuerdo con la receta del sistema, prepare la mezcla de cebador de plantilla en un tubo de PCR esterilizado sin RNasa en hielo. El sistema total es de 13 μl. Este experimento es un experimento inverso que utiliza cebadores oligo dT anclados y cebadores hexámeros aleatorios. . Primero prepare el control NTC, agregue 10 l de agua en el tubo 9, 1 l de cebador oligo dT 50 mM en el tubo 6 y 2 l de cebador hexámero aleatorio 0,6 mM en el tubo 5 y mezcle.

Luego configure el sistema para el tubo de muestra n.° 1 y agregue 1 μl de ARN total con concentración ajustada, 1 μl de cebador oligo dT, 2 μl de cebador hexámero aleatorio y, finalmente, 9 μl de agua para obtener un volumen total de 13 μl. y mezclar bien. Para otros tubos de muestra, consulte el método de configuración del tubo 1 y agregue el sistema de reacción en secuencia. Nota: La cantidad de plantilla de ARN total se puede ajustar adecuadamente a 10 ng-5 μg, y la cantidad de ARNm se puede ajustar a 1-100 ng.

Si la concentración de la muestra de ARN es baja, se pueden añadir 10μg/ml de ARN MS2 para estabilizar el ARN molde.

Desnaturalice la mezcla de reacción preparada en una máquina de PCR a 65°C durante 10 minutos, lo que puede reducir eficazmente la estructura secundaria del ARN. Después de calentarlo, enfríelo rápidamente en hielo y déjelo por 5 minutos. En la mezcla de cebador del molde de reacción, agregue los siguientes reactivos en orden según la receta del sistema: 5 × tampón de transcriptasa inversa en el tubo 2, mezcla de dNTP en el tubo 4, 40 U/μl de inhibidor de RNasa en el tubo 3, 20 en el tubo 1 U/ μl de transcriptasa inversa en un volumen final de 20 μl.

Si hay un gran número de muestras, preparar primero la mezcla de reacción y luego mezclar con cuidado pipeteando y no agitar. Después de mezclar, centrifugue brevemente en una centrífuga instantánea para permitir que la muestra y la solución de reacción caigan al fondo del tubo de centrífuga. Coloque el tubo de centrífuga en la PCR y configure el programa de acuerdo con los cebadores utilizados y la longitud del fragmento del ARNm objetivo. La temperatura y el tiempo de reacción de este experimento se establecieron como: 25°C durante 10 min y 55°C durante 30 min. Una vez completada la reacción, calentar a 85 °C durante 5 minutos para inactivar la transcriptasa inversa y luego colocar en hielo para detener la reacción. El producto de reacción se puede almacenar a 2-8°C durante 1-2 h, o a -15 a -25°C durante un tiempo más largo.

El producto de ADNc se puede utilizar en reacciones de PCR posteriores sin necesidad de purificación. Se puede utilizar un sistema de reacción de PCR de 20 μl para amplificar de 2 a 5 μl de productos de reacción de ADNc. La transcriptasa inversa de este kit tiene actividad RNasa H, que puede eliminar el molde de ARN después de la síntesis de ADNc y reducir su impacto en la PCR posterior.

En esta parte del experimento, seleccionamos el kit SYBR Green I Master de Roche para un análisis cuantitativo absoluto básico.

Este experimento *** configura 5 muestras estándar, incluido 1 control en blanco marcado como 0, y 5 muestras de transcripción inversa, incluido el control NTC. Debido a la gran cantidad de muestras, primero prepare las muestras sin plantilla. El sistema total se dividió en 10 tubos. Después de agregar la plantilla de cada muestra, cada muestra se dividió en 3 pocillos duplicados.

De acuerdo con la receta del sistema, agregue 2x Master Mix con tapa verde, 10x Primer imprimadores ascendentes y descendentes y agua de grado PCR. Una vez preparado todo el sistema, utilice una pipeta para pipetearlo suavemente de manera uniforme y luego divídalo en 10 tubos, cada uno de los cuales contiene 55 l. Añadir la concentración ajustada de ADNc correspondiente a cada muestra en 10 tubos. Para STD cero, agregue 6 l de agua en lugar de la plantilla, y para las ETS restantes, agregue 6 l de la plantilla de muestra estándar que se ha diluido gradualmente. Agregue 6 l de plantilla de ADN con concentración ajustada, incluido NTC, a las muestras de transcripción inversa. Mezclar bien y tomar alícuotas de 20 l de cada muestra en una placa de 96 pocillos. Cubra la placa de 96 pocillos con una película selladora y coloque la placa de varios pocillos en una centrífuga adecuada durante 2 minutos a 1500 × g. Coloque la placa de 96 pocillos preparada en el dispositivo LightCycler® 480.

Haga doble clic para abrir el software 1.5 de LightCycler? 480 e inicie sesión, ingrese automáticamente a la interfaz del software, haga clic en nuevo experimento, seleccione el modo SYBR Green I en la opción Formato de detección, haga clic en Aceptar para completar la configuración. del canal de detección y luego configure el volumen de reacción; para el módulo 96, el sistema de reacción está entre 10 μl y 100 μl. Este experimento consiste en configurar el sistema de reacción en 20 μl.

Ingrese el nombre de la reacción de preincubación en el Nombre del programa, configure 1 ciclo de predesnaturalización y no sea necesario recolectar fluorescencia. La temperatura y el tiempo de ejecución se establecen en 95 °C durante 10 minutos, y la vista se mostrará en tiempo real según la configuración.

Haga clic en el botón Agregar, ingrese Amplificación, defina el número de ciclos de amplificación como 45 y seleccione la función de recolección de fluorescencia Cuantificación, luego establezca la temperatura y el tiempo del ciclo de amplificación por PCR en 95 °C 10 s, y haga clic en el botón Agregar, configure la temperatura y el tiempo de recocido en 60 ℃ 10 s, el modo de adquisición en los dos pasos anteriores se selecciona como Ninguno de manera predeterminada, continúe haciendo clic en el botón Agregar, configure la temperatura y el tiempo de extensión en 72 ℃ 20 s, seleccione Sencillo como modo de adquisición y ajusta la velocidad de rampa automáticamente, no es necesario configurarla nuevamente.

Configure la curva de disolución, ingrese Curvas de fusión en una nueva línea en Programa, 1 número de ciclo, seleccione Curvas de fusión en Modo de análisis, establezca el tiempo y la temperatura en 95 ℃ 5 s, haga clic en el botón Agregar para agregar una nueva configuración La temperatura y el tiempo son 65 ℃ 1 min, y el modo de adquisición en los dos pasos anteriores es Ninguno de forma predeterminada. Haga clic en el botón Agregar, establezca la nueva temperatura en 95 °C, seleccione Continuo para el modo de adquisición y no necesite cambiar otras configuraciones.

Configure el proceso de conservación del calor Enfriamiento, que solo requiere 1 ciclo sin recolectar fluorescencia. Configure la temperatura y el tiempo a 40 ℃ y 1 min. Una vez completada la configuración, haga clic en el botón Guardar a la derecha para guardar el programa configurado. En este punto, se han configurado todo el sistema del ciclo de PCR y los ajustes de temperatura.

Haga clic en Iniciar ejecución para comenzar a ejecutar la reacción de PCR. En este momento, el estado de amplificación de la muestra se puede monitorear en tiempo real en el software.

Una vez finalizado el experimento, haga clic en Editor de muestras para ingresar al área de edición de muestras.

Seleccione Abs Quant en Seleccionar flujo de trabajo. Edite muestras según cómo estén dispuestas en la placa. Establezca controles negativos, controles en blanco, estándares, muestras desconocidas, etc.

En Seleccionar muestra, seleccione el pocillo de muestra que desea configurar. Ingrese el nombre del grupo de muestra seleccionado en Nombre de la muestra en la siguiente columna, seleccione el tipo de grupo de muestra en Tipo de muestra y, finalmente, haga clic en Crear réplicas para configurar pocillos duplicados. Al configurar el estándar, debe ingresar el número de copia. Solo necesita ingresar el factor de dilución y la concentración inicial. Después de editar la muestra, se puede realizar el análisis de datos. La edición de subconjuntos también es posible si es necesario.

Una vez editada la muestra, se pueden analizar los resultados experimentales.

Haga clic en el botón de suma en la parte inferior de la columna izquierda y aparecerá toda la información sobre el experimento, incluyendo: el programa de reacción diseñado, análisis de los resultados experimentales, etc.

Haga clic en Análisis para realizar un análisis detallado y preciso basado en los datos existentes de la muestra.

Haga clic en Abs Quant segunda derivada máxima, aparecerá la ventana crear nuevo análisis, seleccione el área de distribución de la muestra analizada en la opción Subconjunto, haga clic en Aceptar y aparecerá el gráfico de análisis: la amplificación. curva de la muestra correspondiente.

La curva estándar es una curva estándar derivada de un producto estándar. El lado izquierdo de la curva está marcado con eficiencia de amplificación, pendiente, intersección, relación lineal y tasa de error. Generalmente, cuanto menor sea el valor de "Error", mayor será la precisión del experimento.

Si la eficiencia de amplificación está más cerca de "2", significa que la reacción de amplificación es mejor esta vez.

En la tabla de datos, se puede mostrar el valor de Cp de una sola muestra y el valor de concentración de la muestra correspondiente.

Realice estadísticas de datos basadas en múltiples pozos, mostrando el valor promedio de Cp, la varianza, el valor promedio de concentración y la varianza.