¿Cómo diseñar imprimaciones?

El diseño del cebador se puede realizar desde tres aspectos: longitud del cebador, intervalo de amplificación y composición del cebador.

Mejore la eficiencia y la especificidad de la amplificación y suprima la amplificación no específica tanto como sea posible. Longitud: 15 ~ 30 pb es aceptable, el uso común es aproximadamente 20 ± 3 nt, pero la diferencia no debe ser mayor que 38; de longitud entre los dos cebadores es lt;

2. Rango de amplificación: (1) Longitud: 200-500 pb (preferiblemente 100-300 pb); (2) Longitud: 200-500 pb (preferiblemente 100-300 pb), o menos de 400; En términos de diseño de imprimación, se puede realizar la composición de la imprimación. , también puede ser inferior a 400); (2) Diseño de cebadores de intrones cruzados: es decir, los cebadores deben abarcar diferentes límites de intrones antes y después para distinguir o eliminar la amplificación del ADNg.

Cuando el ADN transcribe el ARNm, los intrones se cortarán y, teóricamente, todos los exones quedarán retenidos en el ARNm; el propósito de diseñar cebadores de intrones cruzados es amplificar solo la secuencia del ARNm durante la amplificación, sin amplificar. la secuencia del ADN genómico.

src="/50/v2-5e1fc11db0cd0863c9b97c74d869efcf_720w.jpg?source=1940ef5c "data-rawwidth=" 449 "data-rawheight="239 "data-size="normal "data-original-token= "v2-25accc74e12e1f7b3ba1cc818715cfab"

class="origin_image zh-lightbox-thumb" width="449" data-original="/v2-5e1fc11db0cd0863c9b97c74d869efcf_r.jpg?source=1940ef5c"/gt; ) Cebadores con intrones 3. Componentes del cebador: (1) Es mejor distribuir ATGC al azar para evitar más de 4 ± 1 cadenas de nucleótidos de purina o pirimidina.

(2) El contenido de GC es preferiblemente de 40 a 60. Muy poco GC dará como resultado un efecto de amplificación deficiente y demasiado GC fácilmente causará bandas no específicas. En particular, el extremo 3' del cebador no puede tener tres G o C consecutivos; de lo contrario, el cebador será complementario a la región rica en G o C en el ácido nucleico, afectando así la especificidad de la PCR. Excepto en circunstancias especiales, a veces poli C se coloca en el extremo 5' del cebador para que el ARN no se degrade fácilmente durante la transcripción in vitro; además, el contenido de GC de los cebadores aguas arriba y aguas abajo no debe ser demasiado diferente;

(3) Evite secuencias complementarias: secuencias autocomplementarias: el cebador en sí no debe tener secuencias repetidas invertidas o gt; secuencias autocomplementarias 3nt, de lo contrario el cebador se plegará en una estructura de horquilla (Hairpin) , haciendo que la imprimación sea compleja. Esta estructura secundaria puede afectar la hibridación con la secuencia diana que se va a agregar debido a barreras estéricas.

Esto significa que el cebador en sí no puede tener cuatro bases complementarias consecutivas. Cebadores-dímeros: dos cebadores no pueden tener secuencias complementarias, especialmente en el extremo 3'; de lo contrario, se formarán cebadores-dímeros o dímeros cruzados idénticos, lo que dará como resultado bandas de amplificación no específicas. Es decir, el cebador no puede tener cuatro bases complementarias consecutivas en su extremo 3'.

4. Tm: El valor de Tm (temperatura de fusión) es la temperatura de fusión del oligonucleótido, es decir, el 50% de la temperatura de fusión del oligonucleótido bicatenario bajo una determinada concentración de sal. Su temperatura inicial efectiva es generalmente de 5 a 10°C mayor que el valor de Tm. Se puede calcular según la fórmula Tm=4×(G C) 2×(A T)-4℃, y el valor de Tm es aproximadamente 58±2℃.

Los valores de Tm de los dos cebadores deben ser similares, y la diferencia no debe ser superior a 5°C. La diferencia entre los valores de Tm del producto amplificado y el cebador debe ser de 10°C para garantizar una desnaturalización eficaz del producto amplificado durante el ciclo de PCR.

5. G: (1) El valor G es la energía libre necesaria para la formación de dobles cadenas de ADN. El valor ΔG puede reflejar la complementariedad y estabilidad del cebador y la plantilla. Si el valor ΔG es demasiado alto, significa que la coincidencia entre el cebador y la plantilla es demasiado débil o que la hibridación es inestable, en términos generales, el valor ΔG del cebador debe estar entre 3 y 9 kcal/mol (el valor ΔG es un; valor negativo, y aquí se toma el valor absoluto).

(2) La energía de las estructuras de cebador-dímero y horquilla generalmente no debe exceder las 4,5 kcal/mol; de lo contrario, es fácil producir bandas de cebador-dímero y reducir la concentración de cebadores, lo que da como resultado una PCR normal. La reacción no puede continuar. Los valores de G del extremo 5' y medio del cebador deben ser relativamente altos, mientras que el extremo 3' debe tener un valor bajo. El extremo 3' del cebador tiene un alto valor A/G, lo que facilita la formación de una estructura bicatenaria en el sitio del desajuste e inicia la polimerización del ADN.

6. Extremo 3': El extremo 3' del cebador es el punto de partida de la extensión, por lo que debe emparejarse con precisión con la plantilla, especialmente la última penúltima base, para evitar bases finales no apareadas. fallido.

①Cuando el final es T o A, la falta de coincidencia también desencadenará la síntesis de la cadena. Por lo tanto, siempre que sea posible, se deben evitar los terminales T y A. Las bases en el extremo 3' del cebador son preferiblemente G y C relativamente estables. (③ El extremo 3' debe ser una secuencia de aminoácidos conservada, es decir, aminoácidos con menos conexiones de codones, como Met y Trp. La posición oscilante de la tercera base del codón triple debe evitarse en el extremo 3' de el cebador. El extremo 3' del cebador Es mejor evitar la tercera posición del codón

7. Solo limita la longitud del producto de la PCR y tiene poco efecto sobre el. especificidad de amplificación. El extremo 5' del cebador se puede modificar. El extremo 3' no se puede modificar siempre que la longitud combinada con la plantilla sea suficiente, no es necesario que el extremo 5' del cebador sea complementario a la plantilla. ADN, hasta unas pocas docenas de bases. Por tanto, se puede modificar el extremo 5' del cebador, como añadir restricciones de sitio marcado con biotina, fluoresceína, digoxigenina, etc.

8. Los cebadores se diseñan mejor dentro de la región conservada del ADNc molde y no deben confundirse con otras secuencias en la base de datos de secuencias de ácidos nucleicos. No debe haber una homología obvia y no debe haber 8 bases consecutivas que sean completamente complementarias a la secuencia exterior. la región a amplificar. Esto se puede verificar mediante pruebas BLAST en ellos.

Los cebadores a menudo se verifican, podemos encontrar un determinado par de cebadores en un artículo o en el resto de materiales en el laboratorio. A menudo es posible que no sepamos qué hacer en este momento. Aquí recomendamos un método simple para verificar los cebadores.

1. Sitio web recomendado para el diseño y verificación de cebadores de URL: Primer-Blast, que es una herramienta específica. se utiliza para diseñar cebadores o sondas en secuencias conocidas. Con BLAST-Primer, puede ingresar una secuencia o un conjunto de secuencias y diseñar cebadores o sondas para estas secuencias para su uso en experimentos de biología molecular como la amplificación por PCR o la detección de hibridación. Tenga en cuenta que NCBI también tiene un sitio web llamado BLAST: tenga cuidado de no confundir los dos.

BLAST (Herramienta de búsqueda de alineación local básica) se utiliza para encontrar similitudes de secuencias en grandes bases de datos biológicas. incluyen: encontrar homólogos de una determinada secuencia de ADN o proteína en bases de datos conocidas y determinar la homología, la función de la proteína y la clasificación de especies.

2) NFATc4 (cebador directo/directo, cepa de ratón). /m): 5'-CATTGGCACTGCAGATGAG-3'; 2) NFATc4 (cebador inverso/inverso, cepa de ratón/m): 5'-CATTGCCACTGCAGATGAG-3'.

3. Paso de verificación 1) Complete los "parámetros del cebador" de los cebadores directos e inversos (Figura 3.1)lt; img src="/50/v2-15013936ec063179ad3ea0628ba5fde7_720w.jpg?source=1940ef5c "data -rawwidth=" 1367 "data-rawheight=source=1940ef5c"/gt; "Parámetros de verificación de especificidad de emparejamiento de cebadores" área de base de datos objetivo y selección de especies

Dado que los cebadores trans-end detectan principalmente la región CDS correspondiente al ARNm , por lo que la base de datos seleccionada es Refseq mRNA, que es la última versión de la secuencia de referencia enumerada por NCBI. Haga clic en "?" "Ver. RefSeq es una base de datos de NCBI que contiene información sobre genomas, transcriptomas, proteínas y otras secuencias.

Refseq Representative Genome es un tipo de base de datos NCBI RefSeq que contiene secuencias genómicas representativas. Estas secuencias son anotadas automáticamente por el Genome Annotation Pipeline del NCBI y son las secuencias del genoma más completas y precisas de la base de datos RefSeq del NCBI.

Estas secuencias del genoma generalmente se derivan de literatura publicada u otras fuentes públicas*, como. como GenBank, EMBL, etc. RefSeq mRNA, por otro lado, es una base de datos NCBI RefSeq que contiene secuencias de mRNA conocidas. Estas secuencias generalmente provienen de literatura publicada u otras bases de datos públicas****, como GenBank, EMBL et al.