Cómo estudiar el efecto de un gen sobre la proliferación de virus
Efectos de la interferencia de doble gen de BmNPV en la proliferación del virus
El virus de la poliedrosis nuclear Bombyx mori (BmNPV) causa poliedrosis nuclear en los gusanos de seda. Es uno de los gusanos de seda más comunes y graves. Enfermedades en la producción serícola. Cómo mejorar la resistencia de los gusanos de seda a este virus y generar variedades resistentes a enfermedades siempre han sido temas candentes en la investigación de la sericultura. En los últimos años, la tecnología RNAi se ha desarrollado rápidamente y se ha utilizado ampliamente en investigaciones como la identificación de funciones genéticas y la mejora de rasgos. Este estudio combina la tecnología RNAi con tecnología transgénica para estudiar el impacto de genes clave de la infección por BmNPV y su replicación en la proliferación del virus. Los principales resultados de la investigación son los siguientes: 1. Tomando el factor de expresión temprana ie2 de BmNPV, los factores de expresión tardía lef1, lef2, lef3 y el gen gp64 de la proteína de la envoltura viral como objetivos de inhibición, se conectaron al promotor 39k y al promotor ie1 del virus BmNPV. respectivamente para construir 2 vectores de interferencia transgénica de doble gen a nivel de célula individual (pBac[A3EGFP-39kpdsie2-39kpdsgp64afm], pBac[A3EGFP-39kpdslef3-39kpdsgp64afm], abreviado respectivamente como: pBacA3EGFP-KEG, pBacA3EGFP-KFG) y tres transgenes de doble gen de nivel en gusanos de seda Vector de interferencia (pBac[3xp3dsRed-39kpdsie2-39kpdsgp64afm], pBac[3xp3dsRed-39kpdslef3-39kpdsgp64afm], pBac[3xp3dsRed-ie1pdslef2-39kpdslef1afm], respectivamente ted como: pBac3xp3dsRed -KEG,pBac3xp3dsRed–KFG,pBac3xp3dsRed –EF2KF1). 2. El vector de interferencia a nivel celular construido se transfirió a células embrionarias de gusano de seda (BmE-SWU1) mediante transfección transitoria. Después del desafío con BmNPV, se descubrió que el gen diana dsRNA desempeñaba un cierto papel en la replicación y proliferación de BmNPV en las células. efecto inhibidor. Independientemente de la tasa de infección o la cantidad de poliedros virales producidos, las células transgénicas fueron más bajas que las células no transgénicas. En la etapa inicial de la infección viral, el efecto inhibidor del vector pBacA3EGFP-KEG sobre el virus fue mejor que el de pBacA3EGFP-KFG, pero en la etapa posterior de la infección viral, los resultados fueron opuestos. Y en las células transfectadas con el vector de interferencia, la expresión de genes virales se inhibió significativamente. 3. Inyectar tres vectores de interferencia transgénicos de doble gen a nivel individual de gusanos de seda en huevos de gusanos de seda mediante microinyección y obtener con éxito materiales transgénicos con potencial resistencia a enfermedades. Mediante análisis de PCR inversa, en el sistema transgénico, se insertó aleatoriamente ADN exógeno en el genoma del gusano de seda de acuerdo con el sitio de transposición TTAA específico de piggyBac. Y mediante la detección de transferencia Southern, se descubrió que la mayoría de las líneas transgénicas tenían copias únicas y solo pBac3xp3dsRed-KEG tenía 2 copias. Después de investigar la tasa de mortalidad después de la exposición a BmNPV, se descubrió que, en comparación con el grupo de control, el grupo experimental era significativamente más resistente a la replicación y proliferación del virus.