PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real——RT-QPCR

En la actualidad, la PCR cuantitativa por fluorescencia en tiempo real se ha utilizado ampliamente, como por ejemplo: análisis de especificidad de amplificación, análisis cuantitativo de genes, genotipado, análisis de SNP, etc... El método más utilizado de PCR cuantitativa por fluorescencia es Método no específico de tinte de unión al ADN SYBR Green I y método específico de sonda de hidrólisis Taqman

Método no específico de SYBR Green I (Kit: LightCycler 480 SYBR Green I Master)

SYBR Green I es un tinte con una longitud de onda de excitación verde que se une a la región del surco menor de todas las dobles hélices de ADNbc. En estado libre, SYBR Green I emite una fluorescencia débil, pero una vez combinado con ADN bicatenario, la fluorescencia aumenta considerablemente. Por lo tanto, la intensidad de la señal de fluorescencia de SYBR Green I está relacionada con la cantidad de ADN bicatenario, y la cantidad de ADN bicatenario presente en el sistema de PCR se puede detectar en función de la señal de fluorescencia.

1. Preparación antes del experimento:

Reactivos y consumibles experimentales:

Reactivos: cebadores específicos para PCR, ARN total recién extraído para su uso posterior

Kit: Kit de síntesis de ADNc de primera hebra del transcriptor, LightCycler 480 SYBR Green I Master

El tubo 1 contiene:

ADN polimerasa Taq de inicio en caliente, tampón de reacción, mezcla de dNTP, SYBR Green Tiño, MgCI2

Instrumentos y consumibles:

Instrumento de PCR cuantitativa en tiempo real Roche LightCycler 480 totalmente automático y compatible con placas de 48 o 96 pocillos Instrumento de PCR Thermo Scientific Arktik, F1 Single; pipetas de canal, cajas de hielo, puntas en caja QSP, etc.

Antes de comenzar el experimento formal, descongele cada reactivo en hielo. Nota: SYBR Green I Master debe protegerse de la luz.

2. Transcripción inversa

Nota durante las operaciones experimentales: todas las operaciones relacionadas con el ARN requieren el uso de guantes para evitar la contaminación por ARNasa. Siga estrictamente las instrucciones de uso del kit y realice las operaciones pertinentes.

Según la receta del sistema, preparar la mezcla Templateprimer en un tubo de PCR esterilizado sin ARNasa en hielo, con un sistema total de 13ul. Este experimento es una transcripción inversa utilizando una combinación de cebadores oligo dT anclados y cebadores hexámeros aleatorios.

(1) Prepare el control NTC: (total 13ul)

Agua - 10ul

cebador oligo dT - 1ul

cebador hexámero aleatorio - 2ul

Mezclar bien

(2) Preparar los tubos 1, 2, 3 y 4: (total 13ul)

ARN total (s1, s2, s3, s4)——1ul

cebador oligo dT——1ul

cebador hexámero aleatorio——2ul

agua—— 9ul

Mezclar bien

Nota: La cantidad de plantilla de ARN total se puede ajustar adecuadamente a 10 ng-5 ug, y la cantidad de ARNm se puede ajustar a 1-100 ng. Si la concentración de la muestra de ARN es baja, se pueden agregar 10 ug/ml de ARN MS2 para estabilizar el ARN molde.

(3) Desnaturalice la mezcla de reacción preparada a 65 °C durante 10 minutos en una máquina de PCR. que puede reducir eficazmente la degradación de la estructura secundaria del ARN.

Después de calentarlo, enfríelo rápidamente en hielo y déjelo durante 5 minutos.

(4) Agregue los siguientes reactivos a la mezcla de Templateprimer de reacción:

Prepare la mezcla total (excepto la plantilla de ARN y cebadores)

Tampón de transcriptasa inversa 5X——24ul (tubos de 4ulX6)

Mezcla de dNTP——12ul (tubos de 2ulX6)

40U/ul de inhibidor de ARNasa—— 3ul (tubos de 0,5ulX6)

20U/ul de transcriptasa inversa - 3ul (tubos de 0,5ulX6)

Volumen total de la mezcla - 42ul (tubos de 7ulX6)

Si hay Si hay una gran cantidad de muestras, primero prepare la mezcla de reacción y luego distribúyala en cada tubo de reacción. Mezcle cuidadosamente pipeteando y sin agitar. Mezclar bien y centrifugar en una microcentrífuga hasta que la muestra y el tubo de centrífuga caigan al fondo del tubo.

Colocar el tubo de centrífuga en la máquina PCR y configurar el programa según los cebadores utilizados y la longitud del ARN diana:

25℃ 10min

55 ℃ 30min

85℃ 5min

Finalmente colocar en hielo para detener la reacción.

Este producto de reacción se puede almacenar a 2 ℃ -8 ℃ durante 1-2 h, o a -15 ℃ a -25 ℃ durante más tiempo. El producto de ADNc se puede utilizar en reacciones de PCR posteriores sin purificación. Un sistema de reacción de PCR de 20 ul puede tomar de 2 a 5 ul de productos de reacción de ADNc para la amplificación. La transcriptasa inversa de este kit tiene actividad RNasa H, que puede eliminar el molde de ARN después de la síntesis de ADNc y reducir su impacto en la PCR posterior

Preparación del sistema de reacción SYBR Green:

Utilice LightCycler 480 SYBR Green I Master para análisis cuantitativo absoluto básico.

Diseño experimental: 5 muestras estándar (incluido 1 control en blanco)

5 muestras de transcripción inversa (incluido 1 control NTC Abreviatura de control de plantilla negativa)

Debido a la gran cantidad de muestras, la configuración es la siguiente:

El sistema total sin plantilla (594ul) - dividido en 10 tubos (55ul por tubo) - a cada tubo se le agrega su propia plantilla (6ul) - cada uno tubo Divida las muestras individuales en 3 tubos múltiples (20ul cada uno)

Prepárelo según la fórmula del sistema:

2x Master mix (tapa verde) - 330ul (10ulX33)

¿Mezcla de imprimador 10x?—— 66ul（2ulX33）

Agua de grado PCR (tapa incolora)——198ul（6ulX33）

Volumen total——594ul

Use una pipeta para mezclar suavemente pipeteando, luego divida en 10 tubos, cada tubo tiene 55ul.

Grupo control estándar: Añadir en cada tubo la concentración ajustada de ADNc correspondiente a cada muestra, añadir 6ul de agua al control en blanco en lugar de la plantilla, y añadir 6ul de la plantilla escalar que se ha ido diluyendo gradualmente. al control en blanco.

Grupo de muestra de transcripción inversa: Añadir 6ul de ADN plantilla con concentración ajustada, incluido NTC.

Después de mezclar, distribuya cada muestra en una placa de 96 pocillos a 20 ul/pocillo y cubra la placa de 96 pocillos con una película selladora. Coloque la placa de varios pocillos en una centrífuga adecuada y centrifugue a 1500 g durante 2 minutos a temperatura ambiente, luego coloque la placa de 96 pocillos preparada en el Roche LightCycler 480

Configuración y funcionamiento del programa de PCR:

(1) Haga doble clic para abrir el software LightCycler 480 versión 1.5.0SP4 e inicie sesión para ingresar automáticamente a la interfaz del software.

(2) Haga clic en Nuevo experimento

(3) Establezca el volumen de reacción (para una placa de 96 pocillos, el volumen de reacción es 10ul-100ul), esta vez establecido en 20ul

(4) Ingrese el nombre de la reacción preincubación en Programa y configure un ciclo preparatoriamente sin recolección de fluorescencia

(5) Haga clic en el botón Agregar, ingrese amplificación, defina el número de ciclos de amplificación como 445 y seleccione la función de recolección de fluorescencia Cuantificación

(6) Establezca la temperatura y el tiempo del ciclo de amplificación de PCR en 95 °C 10 s

(7) Haga clic en el botón Agregar y configure el recocido temperatura a 60 °C 10 s

6.7 El modo de análisis de dos pasos está predeterminado en Ninguno

(8) Establezca la temperatura y el tiempo de extensión en 72 °C 20 s y seleccione Único para el modo de adquisición

(9) Configure la curva de disolución, ingrese Curva de fusión en una nueva línea del programa, seleccione Curvas de fusión para el modo de adquisición 95 ℃ 5 s, agregue una nueva temperatura establecida y haga clic en el botón Agregar, 65 ℃ 1 min. El modo de adquisición predeterminado es Ninguno para los dos pasos anteriores

(10) Haga clic en el botón Agregar, 95 ℃ Seleccione Continuo para el modo de adquisición y no es necesario cambiar ninguna otra configuración.

(11) Configure el proceso de conservación del calor, enfriamiento, 1 ciclo, no requiere fluorescencia, 40 ℃ 1 min

(12) Una vez completada la configuración, haga clic en el botón Guardar a la derecha para guardar el programa configurado

(13) Haga clic en Iniciar ejecución para iniciar la reacción de PCR. En este momento, el estado de amplificación de la muestra se puede monitorear en tiempo real en el software.

Edición de muestras

(1) Una vez finalizado el experimento, haga clic en Editor de muestras para ingresar al programa de edición de muestras.

(2) Seleccione ABs Quant en el flujo de trabajo seleccionado para la cuantificación absoluta, edite la muestra de acuerdo con la disposición de la muestra en la placa, configure el control negativo, el control en blanco, el estándar, etc., seleccione el pocillo de la muestra en SELECCIONAR muestra

(3) Ingrese el muestra seleccionada en Nombre de muestra Nombre

(4) Finalmente, haga clic en hacer réplicas para configurar pocillos duplicados

(5) Al configurar el estándar, debe completar el número de copia, dilución factor y concentración inicial

(6) Después de editar la muestra, se puede realizar el análisis de datos y, si es necesario, también se puede realizar un análisis intergrupo

Análisis de resultados

(1) Haga clic en SUMA en la parte inferior izquierda. Se mostrará toda la información, incluido el programa de reacción establecido, el análisis de resultados experimentales, etc.

(2) Haga clic en Análisis para realizar un análisis detallado de los datos existentes

(3) Haga clic en Abs Quant/2nd DerivativeMax para que aparezca la ventana Crear nuevo análisis

(4) Seleccione el área de la muestra analizada en Subconjunto para mostrar el gráfico de análisis y la curva de amplificación de la muestra correspondiente

(5) Curva estándar es la curva estándar derivada del producto estándar. A la izquierda Eficiencia de amplificación, pendiente, intersección, relación lineal y tasa de error (generalmente, cuanto menor es el valor de error, mayor es la precisión experimental. Si la eficiencia de amplificación está más cerca de "2", significa que la reacción de amplificación es mejor) < / p>

(6) En la tabla de datos, se puede mostrar el valor de Cp de la muestra, así como el valor de concentración de la muestra correspondiente. Se pueden realizar estadísticas de datos basadas en pocillos duplicados para mostrar el promedio, la varianza y el Cp. y concentración promedio y varianza