Cómo prevenir la degradación del ARN durante la extracción

Utilizar un desnaturalizante para romper células o tejidos, luego extraer el ARN a través de disolventes orgánicos como el cloroformo, luego precipitar, lavar, secar y finalmente disolver. Sin embargo, dado que la RNasa es ubicua y puede degradar el ARN en cualquier momento, hay muchas cosas a las que se debe prestar atención durante el experimento. Si no tiene cuidado, todos sus esfuerzos serán en vano. 0T3z(F&_,D6c%^"h6YA6_Pasos generales para la extracción de ARN-O:Y+x$p#s8U4M9S Hay cinco puntos clave en todos los procesos de extracción de ARN, a saber: fragmentación eficaz de células o tejidos de muestra; aislamiento eficaz de ácidos nucleicos. Desnaturalización de complejos de proteínas; inhibición eficaz de la RNasa endógena; separación eficaz del ARN del ADN y mezclas de proteínas; para muestras con alto contenido de polisacáridos, también implica la eliminación eficaz de las impurezas de polisacáridos, pero la más crítica es la inhibición de la actividad de la RNasa. En la actualidad, existen dos formas principales de extraer ARN: extraer ácido nucleico total y luego precipitar el ARN con cloruro de litio; extraer directamente en condiciones ácidas, en las que el ADN y las proteínas entran en la fase orgánica mientras que el ARN permanece en la fase acuosa. El método de extracción dará como resultado la pérdida de ARN de pequeño peso molecular y la frecuencia de uso de este método es actualmente muy baja (O(g;^+K)f+i&]%P Pasos experimentales: *l&d6s5e(q1F(g2). |j , ^0s triturar tejido → aislar ARN → precipitar ARN → lavar ARN → fundir ARN → preservar ARN 6D8}.Q; la guanidina ácida, NP-40, SDS, proteinasa K, etc. pueden alterar los tejidos y agregar β-ME puede inhibir la actividad de la RNasa. "s%f,`0[1d*m!]0e2. Generalmente se utilizan disolventes orgánicos como el fenol y el cloroformo para aislar el ARN. , agregue una pequeña cantidad de alcohol isoamílico, después de este paso y centrifugación, el ARN. generalmente se distribuye en la capa superior y se separa de la capa de proteína. 3. Precipitar el ARN con etanol y NaAc 3 M (pH-5,2) o alcohol isopropílico 2@0d&z7?+i,g1@4. etanol A veces, para evitar que el ARN se elimine, este paso se puede omitir. Después del lavado, se puede secar o hornear con etanol, pero no debe estar demasiado seco, de lo contrario no será fácil de disolver. V"o9v+I1J2o9k"z5. TE se usa generalmente para disolver ARN; el ARN aislado de muestras ricas en RNasa (por ejemplo, páncreas, hígado) debe almacenarse en formaldehído para preservar el ARN de alta calidad. Esto es especialmente cierto para el almacenamiento a largo plazo. El ARN extraído del hígado de rata se degrada básicamente en unas pocas semanas, mientras que el ARN extraído del bazo de rata permanece estable después de almacenarse en agua durante 3 años. Además, las transcripciones de más de 4 kb son más sensibles a la degradación por trazas de RNasa. que las transcripciones pequeñas para la estabilidad de la muestra, el ARN se puede disolver en formamida desionizada y almacenar a -70 °C. La formamida utilizada para preservar el ARN no debe contener impurezas que degraden el ARN derivado del páncreas. en medio durante un año. Cuando esté listo para usar el ARN, precipitar el ARN usando el siguiente método: agregar NaAc a 0,3 M y centrifugar a 12.000 xg durante 5 minutos. &P3[7m*^$U$_"?:F"xu*N(?(I Método de cloruro de litio para extraer ARN total: "u;}'I!r'^'^&lEste método utiliza proteína desnaturalizada con urea en alta concentración. también inhibe la RNasa y utiliza cloruro de litio para precipitar selectivamente el ARN. Es particularmente adecuado para extraer pequeñas cantidades de ARN tisular de una gran cantidad de muestras. Tiene la ventaja de ser rápido y sencillo, pero también adolece de la contaminación de una pequeña cantidad. cantidad de ADN, bajo rendimiento de ARN y pérdida de pequeños fragmentos de ARN.

#~*S:}9`*r4Z3P reactivo de prueba: "d$r6Q+_.I8Q1, solución de cloruro de litio/urea cloruro de litio 126 g (3 M) de urea, 360 g (6 M) agregar agua a 1 litro, filtrar y esterilizar 7_8w1t" o9a 'q!i4Z2, suspensión 10 mM?Tris-HCL (pH7,6), 1 mM?EDTA (pH8,0), 0,5% SDS!m8Q4R,]&y:b#`7d Pasos de prueba: 7[6?$`* }; o7_Z'{1. Para una gran cantidad de tejido o células, agregar 5-10 ml de solución de cloruro de litio-urea por gramo de tejido o célula y homogeneizar a alta velocidad durante 2 minutos para una pequeña cantidad de células (107 células/; ml), luego agregar 0,5 ml de solución de cloruro de litio-urea por gramo de tejido o células, homogeneizar manualmente y transferir a un tubo Eppendof. &Y)b:E,Q"l/^Q:\$s2. Después de colocar el líquido homogeneizado a 0-4 ℃ durante 4 horas, centrifugar a 12000 g durante 30 minutos. x-C6D-N/N0K!t2a3. Tomar el precipitado y agregue el original Agregue 1/2 volumen de solución de cloruro de litio-urea a la solución de homogeneización y repita el paso 2. )y-x) S0K9y6j, e4 Después de que la precipitación se reconstituya con 1/2 volumen de la solución de homogeneización original, agregue un volumen igual. Deje el fenol/cloroformo/alcohol isoamílico a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos y agite ocasionalmente para mezclar. Centrifugue a 4000 g durante 3d2v'i1~(~*D5. Tome la fase acuosa superior y agregue. 1/10 veces el volumen de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y 2 veces el volumen de etanol, colocar a -20°C durante 1 hora y centrifugar a 5000 g L4a'Q4u"l:a*K%Z$. ?(e6, lavar el precipitado una vez con etanol al 70%. Secar al vacío. r0[/Q'G9q7. Disolver el precipitado en solución de ARN para obtener ARN, tomar alícuotas y almacenar a -70°C. 0f.X%R(H %B7g!y7j5u$C'|)[%~!J3D:Q Protease- Método de fenol caliente 6 | "^0b*[)P3S*c4b4H4l Este método es adecuado para la extracción de ARN viral /ml), J5pl6V/t7[ /I2, 2× tampón: 1%SDS?20mMTris-HCL(pH7.6)?0.2MnaCL9h,p]y+\$Z)O pasos de prueba: #W3v8G1[$]5y1, agregue un volumen igual de tampón y proteinasa K al líquido del virus purificado e incubar a 37 °C durante 40-50 minutos. Incubar a 65 °C durante 5 minutos y luego centrifugar. Tomar el sobrenadante y extraerlo una vez con cloroformo.,|(Z0d;j2@7m+d2Q&xH4. Tome la fase acuosa superior, agregue 1/10 veces el volumen de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y 2 veces el volumen de etanol, colóquelo a -20 °C durante 1 hora y centrifugue a 5000 g (10000 g, 10 min). Etanol al 70%. Lave el precipitado una vez. Seque al vacío. {(w%]3a*y,Oe)P6. Disolver el precipitado con solución de disolución de ARN, tomar alícuotas y almacenar a -70 ℃. el proceso de extracción de ARN vegetal)o5B7d/Q3_Interferencia y contramedidas de compuestos fenólicos: a9D*Z3K?7WMuchos tejidos vegetales, especialmente los frutos de las plantas (como manzanas, cerezas, ciruelas, uvas, etc.) y plantas arbóreas son ricos en compuestos fenólicos. compuestos El contenido de compuestos fenólicos aumenta a medida que la planta crece, lo que facilita la extracción de ARN del material vegetal joven. Además, el contenido de polifenoles en las agujas de las plantas coníferas es mucho mayor en las hojas de las plantas de hoja caduca. El material vegetal se homogeneiza, se liberan fenólicos, lo que hace que el homogeneizado se vuelva marrón después de la oxidación, lo que aumenta con el grado de oxidación. Este fenómeno se denomina efecto pardeamiento. Los compuestos fenólicos oxidados (como las quinonas) pueden unirse de manera estable al ARN, afectando así el aislamiento y la purificación del ARN. Sin embargo, Newbury et al. encontraron que no existe correlación entre la dificultad de la extracción de ARN y la cantidad total de compuestos fenólicos en el material. Por lo tanto, creen que no todos los compuestos fenólicos afectan la extracción de ARN.

Sin embargo, en general se cree que los llamados "taninos condensados", es decir, polihidroxiflavonoles polimerizados (como las proantocianidinas), son una clase de compuestos que afectan la extracción de ARN. El enfoque general actual para eliminar compuestos fenólicos es evitar la oxidación durante las etapas iniciales de extracción antes de separarlos del ARN. 9b0S!}0U6|9k/l!v"vg1~/@Métodos para evitar la oxidación de compuestos fenólicos:"v;y,a4k7n/Z1 Método del agente reductor: Generalmente, se añade (-mercaptoetanol, dihidrógeno, etc.) El tampón de extracción tiotreitol (DTT) o cisteína se puede utilizar para evitar que las sustancias fenólicas se oxiden. A veces, la concentración de (-mercaptoetanol en la solución de extracción puede llegar al 2%. (-mercaptoetanol, etc. también puede interrumpirse. la oxidación de la polifenol oxidasa. Su et al. creen que agregar (-mercaptoetanol (concentración final 1%) al precipitar el ARN durante la noche puede prevenir la oxidación de compuestos fenólicos durante el proceso. El borohidruro de sodio (NaBH4) es un agente reductor de quinona reducible. Al tratarlo, se puede reducir el color marrón del tampón de extracción y los compuestos de quinona se pueden reducir a compuestos de polifenol &H.z.p+~&t%t5G&G1M-P/q!u2, método del agente quelante: agente quelante. El grupo -N= en la mezcla de polivinilpirrolidona (PVP) y polivinilpolipirrolidona (PVPP) tiene una gran capacidad para unir compuestos de polifenol, y su capacidad de unión aumenta a medida que aumenta el número de grupos hidroxilo del anillo aromático en el compuesto de polifenol. Las proantocianidinas contienen muchos hidroxilo. grupos en los anillos aromáticos, por lo que pueden formar complejos estables con PVP o PVPP insoluble, de modo que las proantocianidinas no puedan convertirse en sustratos para la polifenol oxidasa y se oxidarán en el paso de extracción posterior. El valor del pH es un factor importante al usarlo. PVP para eliminar polifenoles La capacidad de la PVP para unirse a los polifenoles disminuirá rápidamente cuando el pH es superior a 8,0 [11]. p%N0w/t7r3, método del ácido tris-bórico: si el tampón de extracción contiene ácido tris-bórico (pH 7,5), el ácido bórico puede formar un complejo con compuestos fenólicos a través de enlaces de hidrógeno, inhibiendo así la oxidación de los compuestos fenólicos. su unión al ARN es muy eficaz, por lo que López-Gámez et al. ya no lo añaden al tampón de extracción. Sin embargo, si la concentración de ácido Tris-bórico es demasiado alta (>0,2 M), afectará la tasa de recuperación del ARN. #p8]0^8K3a4, método de albúmina sérica bovina (BSA): existe una brecha entre las proantocianidinas y la BSA. Produce una interacción similar a la que existe entre antígeno y anticuerpo, formando un compuesto soluble o insoluble. complejo, que reduce la posibilidad de que las proantocianidinas se unan al ARN, aumentando así el rendimiento de ARN. El efecto de extracción será mejor cuando BSA se combina con PVPP. Dado que BSA a menudo contiene RNasa, se debe agregar heparina para inhibir la actividad de RNasa. )~#H/y(P7Q)j4G*w1G8l5. Método de acetona: Schneiderbauer et al. utilizaron acetona a -70 °C para la extracción, congelación y molienda. El material vegetal final puede aislar eficazmente ARN de alta calidad a partir de materiales vegetales ricos. en compuestos fenólicos como abeto, pino, haya, etc. @+?-X/V9z8T8H:B3C!W'C Eliminación de compuestos fenólicos ：&z#h)G0H&]$I1N"f.l9N Se pueden eliminar compuestos fenólicos no oxidados. precipitando ARN con Li+ o Ca2+. Los polifenoles unidos a PVP, PVPP insoluble o BSA se pueden eliminar directamente mediante centrifugación o durante la extracción con fenol o cloroformo. Manning utiliza una alta concentración de 2-butoxietanol (50%) para precipitar el ARN, mientras que los polifenoles se disuelven en 2-butoxietanol y se eliminan. Luego se lavó el sedimento de ARN con tampón que contenía 2-butoxietanol al 50% para eliminar los polifenoles residuales. Él cree que incluso si los polifenoles se oxidan, sus productos de oxidación aún pueden disolverse en soluciones de 2-butoxietanol de alta concentración y eliminarse, sin necesidad de tratamiento con NaBH4. 5C6Y8a1SV:`2~Interferencia de polisacáridos y contramedidas: 6I-b3R4~$T&O La contaminación por polisacáridos es otro problema espinoso que se encuentra a menudo al extraer ARN de plantas. Los tejidos vegetales suelen ser ricos en polisacáridos y muchas de las propiedades físicas y químicas de los polisacáridos son muy similares a las del ARN, por lo que es difícil separarlos.

Cuando se eliminan los polisacáridos, el ARN también se elimina, lo que da como resultado una reducción en el rendimiento de ARN; cuando se precipita el ARN, también se produce un precipitado de polisacáridos similar a un gel. Este tipo de precipitado de ARN que contiene polisacáridos es difícil de disolver en agua. Se forma después de la disolución. Dado que los polisacáridos pueden inhibir la actividad de muchas enzimas, las muestras de ARN contaminadas con polisacáridos no se pueden utilizar para estudios adicionales de biología molecular. En los métodos convencionales, algunos polisacáridos se pueden eliminar parcialmente mediante tratamiento con clorhidrato de SDS-guanidina; en presencia de altas concentraciones de iones Na+ o K+, algunos polisacáridos se pueden eliminar mediante extracción con fenol y cloroformo, algunos polisacáridos también se pueden retener mediante precipitación con LiCl; ARN en el sobrenadante. Sin embargo, incluso después de estos pasos, todavía se descubre que una cantidad considerable de polisacáridos se mezcla con el ARN, por lo que se necesitan métodos más eficaces para resolver el problema de la contaminación por polisacáridos durante el aislamiento y purificación del ARN vegetal. Los polisacáridos 7[' pueden precipitarse mientras el ARN permanece en la solución. Generalmente se añade etanol al homogeneizado de materiales vegetales. Por ejemplo, Lewinsohn et al. se agregó a una concentración final del 10% para precipitar los polisacáridos. Sin embargo, cuando Tesniere et al extrajeron el ARN del tejido de la baya de la uva, agregaron una concentración final del 30% de etanol a la solución de ARN después de la precipitación con etanol con CsCl para precipitar los polisacáridos para una mayor purificación. Se obtuvieron muestras de ARN. !i5b5m*z9G8M4~-N/D Otro método comúnmente utilizado es el método de precipitación con polisacárido con acetato de potasio. Bahloul et al. agregaron 1/3 del volumen de ácido acético 5 M al sobrenadante del homogeneizado al extraer ARN del tejido de abeto. Solución de potasio (pH 4,8) para precipitar polisacáridos; Ainsworth añadió 1/5 del volumen de solución de acetato de potasio 5 M (pH 4,8) al extraer ARN de hojas de algodón y polen. 6.5) solución al homogeneizado para eliminar impurezas como polisacáridos. Cuando se extrae ARN de ciertos materiales vegetales, se utilizan los dos métodos anteriores en combinación, como López-Gámez, cuando se extrae ARN del mesocarpio de mango, 0,25 volúmenes de etanol absoluto y 0,11. Se añadió un volumen de solución de acetato de potasio 5 M al homogeneizado para eliminar las impurezas de polisacáridos. Su et al. utilizaron etanol o acetato de potasio solos para eliminar los polisacáridos de las algas pardas. Ambos son ineficaces, sólo la combinación de los dos tiene el mejor efecto. 5q1b9[5l1s+nFang et al. creen que la alta concentración de NaCl en el tampón ayuda a eliminar los polisacáridos. Cuando Chang et al extrajeron el ARN de pino, la concentración de NaCl en el tampón fue de 2,0 M y 1,0 M, el ARN y los polisacáridos. Se separa mediante extracción con cloroformo y precipitación con etanol del ARN. Manning diluye el sobrenadante después de la extracción con fenol de las semillas de zanahoria y otros materiales, ajusta la concentración de iones Na+ a 80 mM y luego agrega 0,4 volúmenes de 2-butoxietanol para precipitar y eliminar los polisacáridos. #M'{+{0U%U,K2@,v El impacto y las contramedidas de las impurezas de las proteínas: $@-G5o(f1s9_2V*G2n/^La proteína es otro factor importante que contamina las muestras de ARN. Dado que la RNasa y la polifenol oxidasa también son proteínas , para obtener ARN completo y de alta calidad, las impurezas proteicas deben eliminarse de manera efectiva. El método convencional consiste en moler materiales vegetales en condiciones congeladas para inhibir la actividad de la ARNasa, etc. El tampón contiene desnaturalizantes de proteínas, como fenol, guanidina, SDS, bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), etc., que pueden desnaturalizar y aglomerar la proteína durante la homogeneización; algunos métodos utilizan proteinasa K para desnaturalizar la proteína. Además, se pueden utilizar fenol y cloroformo para extraer proteínas. 'T7v(F1J9@+EWilcockson utiliza la diferente solubilidad de las proteínas y el ARN en una solución de perclorato de sodio para separarlos. En una solución de perclorato de sodio al 70%, la solubilidad del ARN es mayor que la solubilidad de las proteínas, por lo que la mayoría de las proteínas precipitan. Luego agregue el doble del volumen de etanol absoluto al sobrenadante centrifugado. En este momento, el ARN puede precipitar y la proteína residual que se puede disolver en la solución de perclorato de sodio al 70% aún permanece en el sobrenadante.

3qe/\*I"A&@El impacto y las contramedidas de los metabolitos secundarios::N3|)NfK#n;p'f6h0J2A0{Otra dificultad para extraer ARN de alta calidad de los tejidos vegetales es que muchos tejidos vegetales superiores, especialmente los tejidos maduros. Ciertos Se pueden producir metabolitos secundarios solubles en agua. Estos metabolitos secundarios se combinan fácilmente con el ARN y se extraen junto con el ARN, lo que dificulta el aislamiento del ARN biológicamente activo porque estos productos secundarios no se pueden determinar. ¿Cuál es la sustancia específica? No existe ningún método especial para resolver este problema. Baker et al. combinaron el método de precipitación selectiva de Hughes et al., el método de centrifugación en gradiente de cloruro de cesio de Chirgwin y el método de recuperación de ARN de Iversen et al. agujas y otros tejidos vegetales (Ms5O%f!H-Q*\(m"`(}Debido a la compleja diversidad de componentes intracelulares e intracelulares de los tejidos vegetales, especialmente los tejidos vegetales superiores, la extracción de ARN de los tejidos vegetales es relativamente diferente de otros En el caso de los materiales biológicos, es mucho más difícil encontrar que incluso diferentes tejidos de la misma planta tienen métodos de extracción de ARN muy diferentes; si se trata de la misma planta y del mismo material tisular, pero proviene de plantas de diferentes genotipos, los métodos de extracción de ARN pueden ser diferentes, por lo que para una determinada planta o su tejido se debe explorar y practicar el método de extracción de ARN correspondiente. Se puede establecer #S0a#G7L3S&A Con la expansión del campo de investigación de la biología molecular vegetal, se puede decir con certeza que surgirán nuevas dificultades en el proceso de extracción de ARN de materiales vegetales como base de su investigación, pero con exploración continua. Con la acumulación de experiencia, los trabajadores científicos seguramente resolverán estas dificultades rápidamente y allanarán el camino para el desarrollo de la biología molecular vegetal. Algunos métodos especiales en la extracción de ARN vegetal $e*[2U( E%h. '[Extracción de ARN de plantas polifenólicas:!j!d,]2V(R!B&o La manzana, el algodón y otras plantas polifenólicas no se pueden extraer con TRIZOL. Este método ha demostrado ser eficaz. La pureza del ARN no es particularmente alta, pero es suficiente para los reactivos del experimento Northern: #s7s8H!R#W1y#g Tampón de extracción 200 ml: NaCl1.1688g100mMTris2.4228g10mM (tris-HCl8.0) EDTA5.8450g10mMSDS2.0000g1%NaOH a 8,0, ajustar a 200 ml, agregar 200 ulDEPC. Para disolver, agregue inmediatamente 500 ul de fenol cloroformo, luego agregue 500 ul de tampón de extracción, agite vigorosamente durante 1 a 2 minutos y colóquelo en hielo durante 5 minutos. "F3S0V5@0s7i1T2, centrifugar a 12000 rpm a 4 grados durante 15 minutos, transferir el sobrenadante a un tubo nuevo, agregar cloroformo y alcohol isoamílico para extraer una vez). H'L7d#d"y8@3. Tomar 600 ul de alcohol isopropílico y precipitar. a -20 grados durante 20 minutos &w:m2r:I4\4l#J4, centrifugar a 12000 rpm durante 10 min. !I.Y.\8b7A5. Lavar el precipitado con etanol de 70 grados. k!T.D1[0w+?)_0D5?6, 8000rpm5min. "A;y#}'F(`5}6I+N!x7, secar el precipitado y disolver en 30ulDEPC de agua.;^0Q-R+`5j(n'['m9M#m/r3o2O!T6z$`1m&e. ^Método de extracción de ARN de gimnospermas leñosas como Ginkgo biloba: &Ai&V!H0`?6R Las plantas de gimnospermas leñosas como Ginkgo biloba y Xiangji tienen un alto contenido de sustancias secundarias como fenoles y polisacáridos, que tienen gran interferencia con el aislamiento y purificación de RNA., afectando seriamente la calidad y el rendimiento del ARN extraído y obstaculizando la realización de experimentos de biología molecular relacionados.

En la actualidad, existen muchos métodos para extraer ARN. Los kits convencionales de Trizol, SDS y otros métodos no pueden extraer ARN de Ginkgo. Sin embargo, el método CTAB de Shujun Chang et al (1993) extrajo ARN con mala calidad y degradación grave. Se mejoró el procedimiento de extracción para obtener muestras de ARN de Ginkgo de mayor calidad. Reactivos de prueba: disolver en agua DEPC estéril. `4c9{)p2\4t2, 500 mMEDTA: se añaden 18,61 g de EDTA"H2O a 80 ml de agua, se agita para disolver, se ajusta el pH a 8,0 con NaOH y se diluye a 100 ml. x*j!H4y!G4M #q3c5P3, 10mol/LLiCL: 42,4gLiCL, disolver en 100 ml de agua 9i)@a'\&w+cp*g4, tampón de extracción (tratamiento de agua DEPC): 2 % de CTAB (desnaturalizante de proteínas). 2% PVPK30 (Eliminar polifenoles) 100mMTris-HCL (Ph8.0) 25mMEDTA (agente quelante de metales) 2.0MNaCL (eliminar polisacáridos y CTAB) Método de preparación: 2gCTAB, 2gPVP, 10mL1mol/Ltris, 5mL500mMEDTA, 11.7gNaCL, ajustar a 100mL). o+\5E!X;O#A(M+P8H*K9n0q5, espermidina (agregar una pequeña cantidad durante la extracción) (inhibidor de RNasa) Agregar) (eliminar polifenoles)'De,d(J.K$z!O9f7, cloroformo alcohol isoamílico ( 24:1) (proteína de extracto))U)A+]4\#Q8, 10MLiCL (precipitado de ARN macromolecular)7M+b)g4J4m5C0f-\9, SSTE (ARN disuelto) 1,0MNaCL0,5%SDS1mMEDTA (PH8.0)10mMTrisHCL (pH8) Método de preparación: 2,9 g de NaCL, 0,25 g de SDS, 0,5 ml de Mtris, 100 uL de 500 m de MEDTA, pH 8,0, volumen constante a 50 ml, el mortero y el material de vidrio están envueltos. en papel de aluminio y horneado a una temperatura superior a 200 ℃ durante más de 2 horas, o a una temperatura alta de 180 * C 4 horas. ; Esterilizar durante 20 minutos cada vez y luego secar en el horno. ; La solución acuosa tratada se prepara después de la esterilización )) ;F^+e9I#h/Q7m*A*] 1. Agregue 4 ml de solución de extracción a un tubo de centrífuga de 10 ml y caliéntelo en agua a 650 °C. $D+?4w7\3J:w,M2. Use nitrógeno líquido para enfriar el mortero, agregue una pequeña cantidad de PVP antioxidante al mortero, tome 1 g de hojas de ginkgo congeladas a baja temperatura, colóquelas rápidamente en el mortero y agregue líquido. nitrógeno de vez en cuando para evitar que las hojas se derritan durante el proceso de molienda. Después de una molienda completa, agréguelo inmediatamente al tampón de extracción precalentado y mezcle bien agitando a mano. 6C4i+L/Z*C5G)v3, 65 ℃, enfríe el agua a temperatura ambiente después de 1 minuto. (N2@)U:S,{9M"e8f4. Agregar un volumen igual (4 ml) de cloroformo:isoamilo. Aspirar el sobrenadante, agregar un volumen igual (4 ml) de imitación:alcohol isoamílico (24:1), mezclar y centrifugar. a 10.000 rpm, 40C durante 10 min.

.{#k/z5r:x:v1x6. Aspirar el sobrenadante, agregar 1/4 de volumen de IOMLiCL, mezclar y precipitar a 4°C durante la noche, luego centrifugar a 10.000 rpm durante 20 min. 7xP4o6z1D![8} 7. Seque con una pistola, disuelva el precipitado con 500 uLSSTE y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Agregue volúmenes iguales de cloroformo y alcohol isoamílico, mezcle bien y centrifugue a 10000 rpm, 40 °C durante 10 minutos. , H2b7C1d*[6r4c8. Centrifugar y absorber el sobrenadante, añadir el doble del volumen de acetato anhidro y precipitar a -70°C durante al menos 30 minutos, o a -200°C durante 2 horas. "W*c'Y1P-t5K)^,`9, 12000rpm, 40C, centrifugar durante 20 min, lavar dos veces con etanol al 70% y secar el precipitado con secador. 1x,S*X0V"y6F/l10, tratar con 40uLDEPC Disolver el precipitar en agua para obtener muestra de ARN. 8f2C-S4R3O9R4Te&{11. Excepto para la electroforesis y la detección UV, el resto del ARN debe almacenarse en un refrigerador a -70 °C para su uso posterior. Q0o7V.]9x,{1i:__!U*: 4mol de isotiocianato de guanidinio, 20 mmol de EDTA, 20 mmol de MESpH7.0. Solución de trabajo: agregar 400 ml de solución madre y almacenar a 4°C para su uso posterior: 2molLiCl10mmolNaAc. volumen final a 250 ml, pH 5,2, esterilizado y almacenado a 4 °C para su uso posterior 2u;J1S9V8a.j Pasos de la prueba:)O/o,L#q-D8v)U1. liofilizar. Si es necesario, agregue 0,2 g de arena y muela, luego agregue 10 ml de botella de extracción de ARN y mezcle bien. 7nQ:B"SN9B!J$u2. Centrifugar a 8000 rpm durante 10 minutos a 4 ℃. Transferir la fase acuosa superior a un tubo de centrífuga limpio. Añadir un volumen igual de bolsa de extracción de fenol/cloroformo y centrifugar a 8000 rpm durante 10 min a 4 ℃ 1N:K+]3R"a7`3. Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio y lave el sobrenadante una vez con 10 ml de cloroformo (agregue 10 ml de cloroformo, mezcle bien y centrifugue a 8000 rpm durante 10 min a 4). °C). $p+y,P/^-w/E'g"k0y:[4. Transfiera con cuidado el sobrenadante a otro tubo de centrífuga limpio, agregue 1/10vol3molNaAc y 2vol de etanol absoluto frío e incube a -80 ℃ Precipite durante 2 horas :t&M8O1O!C-w5a5, centrifugar a 8500 rpm durante 30 minutos a 4°C, desechar con cuidado el sobrenadante, resuspender el sedimento en resuspensión de ARN y colocar a 4°C durante 1 hora K4v(y%l8Q0a8N) I%. | 6, centrifugar a 8500 rpm durante 10 minutos a 4°C Desechar el sobrenadante y disolver el precipitado en un volumen apropiado de agua tratada con DEOC. Después de la detección, dividir en alícuotas y almacenar a -70°C.