Reciclaje de reactivos y consumibles experimentales
2. Cuando los fragmentos de ADN requeridos estén completamente separados, transfiera el gel a la luz ultravioleta y corte los fragmentos de ADN requeridos lo antes posible.
Nota: Intenta cortar el exceso de gel al cortar, y no expongas el ADN a la luz ultravioleta durante más de 30 segundos.
3. Transfiera el bloque de gel que contiene el fragmento objetivo a un tubo de centrífuga de 1,5 ml (el tubo de centrífuga ha sido pesado) y obtenga el peso del bloque de gel. Determine aproximadamente su volumen. Suponiendo que su densidad es 1 g/ml (la densidad de casi todos los geles de ADN se puede aproximar a 1 g/ml), el volumen del trozo de gel se puede obtener de la siguiente manera: El peso del trozo de gel es 0,2 ml. Agregue un volumen igual de tampón de unión (XP2) y sumérjalo en un baño de agua a 55-65 °C durante 7 minutos o hasta que el gel se derrita por completo. Agite o gire la mezcla cada 2-3 minutos.
Recordatorio importante: una vez que el gel se haya disuelto por completo, preste atención al pH de la mezcla del tampón de unión del gel. Si el valor del pH es superior a 8, el rendimiento de ADN se reducirá considerablemente. Observa el color de la mezcla. Si es naranja o rojo, añadir 5 µl de acetato de sodio 5 M, pH 5,2, para bajar su pH. Después del ajuste, el color de la mezcla volverá a su color amarillo claro normal.
4. Tome una minicolumna HiBind DNA limpia y colóquela en un tubo de recolección de 2 ml limpio (listo).
5. Transferir toda la solución de ADN/coloide obtenida en el paso 3 a la columna. Centrifugar a 10.000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente. Deseche el filtrado en el tubo de recolección y coloque la columna nuevamente en el tubo de recolección de 2 ml.
6. Si el volumen de ADN/gel fundido supera los 700 ul, solo se pueden transferir 700 ul a la columna a la vez y el resto puede continuar repitiendo el paso 5 hasta que todas las soluciones pasen por la columna. Cada columna de purificación y recuperación de ADN Hibind tiene una capacidad máxima de adsorción de 25 g de ADN. Si el resultado esperado es grande, agregue las muestras individualmente en una cantidad adecuada de columnas.
7. Deseche el filtrado en el tubo de recolección, vuelva a colocar la columna en el tubo de recolección de 2 ml, transfiera 300 ul de tampón de unión (XP2) a la columna y centrifugue a 10.000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente.
8. Deseche el filtrado en el tubo de recolección, vuelva a colocar la columna en el tubo de recolección de 2 ml, transfiera 700 ul de tampón de lavado SPW (diluido con etanol absoluto) a la columna y centrifugue a temperatura ambiente durante 10 minutos. 000XG 1 min.
Nota: El tampón de lavado concentrado SPW debe diluirse con etanol según la etiqueta antes de su uso. Si el tampón de lavado de ADN se colocó en el refrigerador antes de usarlo, asegúrese de retirarlo y llevarlo a temperatura ambiente.
9. Lavar la columna repetidamente con 700 μl de tampón de limpieza SPW. Centrifugar a 10.000 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente.
10. Deseche el filtrado en el tubo de recolección y vuelva a colocar la columna en el tubo de recolección de 2ml. Centrifugar a 13.000 x g durante 2 minutos a temperatura ambiente para eliminar el líquido residual de la matriz de la columna.
11. Coloque la columna en un tubo de centrífuga limpio de 1,5 ml, agregue 15 ~ 30 ul (dependiendo de la concentración final esperada del producto) de tampón de elución (o tampón TE) al sustrato de la columna y déjelo reposar a temperatura ambiente. durante 1min y 13.
La primera elución puede eliminar el 70-80% del ADN unido. Si se eluye nuevamente, se puede eluir el ADN residual, pero a una concentración menor.