Tecnología de secuenciación de alto rendimiento y caracterización molecular transgénica

El siguiente artículo es de Frontier of Nucleic AcidDetection Science, autor: hsjsqy20

En los últimos años, con el desarrollo de la tecnología de secuenciación, la caracterización molecular de plantas transgénicas basadas en altos La tecnología de secuenciación de ADN de alto rendimiento se ha convertido en el análisis más preciso. La caracterización molecular de plantas transgénicas proporciona una nueva idea

1. ¿Qué es la caracterización molecular?

La denominada caracterización molecular se refiere a la integración de fragmentos de ADN exógeno de plantas transgénicas en el genoma receptor: incluido el número de copias del gen exógeno insertado, las secuencias flanqueantes del sitio de inserción y la integridad. de la secuencia insertada, si la secuencia principal del vector está insertada, el estado de expresión y la estabilidad genética de la información, etc. La caracterización molecular de plantas genéticamente modificadas es la base para establecer una tecnología de detección precisa para plantas genéticamente modificadas, y también es el contenido principal y el núcleo de la evaluación de seguridad de plantas genéticamente modificadas.

2. ¿Cuáles son los métodos de caracterización molecular de plantas transgénicas?

Actualmente, los métodos comunes para analizar las características moleculares de las plantas transgénicas incluyen la hibridación Southern, la PCR cuantitativa por fluorescencia en tiempo real, la PCR digital, la tecnología de paso de cromosomas basada en PCR, la tecnología de secuenciación de alto rendimiento, etc. Entre ellos, la hibridación Southern, la PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real y la PCR digital de micropocillos son métodos comunes para analizar el número de copias de genes extraños.

3. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de los métodos tradicionales de caracterización molecular de plantas transgénicas?

La hibridación Southern es un método de análisis actualmente reconocido por la agencia reguladora de seguridad de OGM. Tiene las ventajas de una alta precisión y una buena reproducibilidad, pero no puede analizar correctamente la complejidad de insertar múltiples copias en el mismo sitio. Tampoco está claro si el fragmento insertado contiene eliminaciones o mutaciones.

qPCR es un método para el análisis relativamente cuantitativo del número de copias de genes exógenos. Requiere el uso de materiales estándar para dibujar una curva estándar y la selección de genes con números de copias conocidos como genes de referencia. los resultados se ven fácilmente afectados por cebadores y sondas. La influencia de factores como la concentración de la aguja y la pureza del ADN.

La PCR digital es un procedimiento relativamente sencillo que no requiere una curva estándar durante el proceso de medición y permite la cuantificación absoluta de genes extraños. Sin embargo, también tiene desventajas, como requisitos de alta especificidad para sondas fluorescentes, alto costo y bajo rendimiento de las tarjetas de formación de microgotas.

****** Tecnología de paso de cromosomas basada en PCR**** La tecnología de paso de cromosomas basada en PCR incluye TAIl-PCR

(entrelazado térmico asimétrico), PCR inversa (PCR inversa) y la PCR mediada por ligación se utilizan comúnmente para analizar las secuencias de secuenciación de genes extraños en organismos genéticamente modificados. Utilizando estos métodos, se han obtenido con éxito secuencias flanqueantes de cultivos transgénicos como la soja, el maíz y el algodón transgénicos. Sin embargo, estas técnicas a menudo producen bandas no específicas durante el proceso de amplificación y no son adecuadas para el análisis de secuencias flanqueantes de eventos de transformación de inserción multifocal. Además, cuando el fragmento insertado sufre una reordenación de secuencia, es difícil determinar la ubicación del extraño. gen en el genoma del organismo receptor, posición e integridad del inserto.

4. ¿Cuáles son las plataformas para analizar las características moleculares de los transgenes mediante secuenciación de alto rendimiento?

Actualmente, las principales plataformas de secuenciación que se pueden utilizar para el análisis de secuenciación transgénica incluyen Roche/455, Illumina HisSeq, Solid, Heliscope y las plataformas de secuenciación triple PacBio SMRT, Nanopore nanopore sequencing, etc. Los diferentes métodos de secuenciación tienen diferentes ventajas.

5. ¿Cuáles son los métodos de caracterización molecular de organismos genéticamente modificados basados ​​en secuenciación de alto rendimiento?

(1) Análisis de caracterización molecular de organismos genéticamente modificados basado en la secuenciación del genoma completo

Secuenciando el genoma de organismos genéticamente modificados y luego utilizando la secuencia de ADN del vector para capturar exógenos insertados. ADN a partir de los datos de secuenciación La secuencia y la secuencia de la región de unión entre el ADN exógeno y el genoma receptor se utilizan para analizar las características moleculares del organismo genéticamente modificado basándose en la secuencia de la región de unión.

El análisis de caracterización molecular de organismos genéticamente modificados basado en la secuenciación del genoma completo se puede utilizar para analizar las secuencias flanqueantes de secuencias insertadas exógenas en organismos genéticamente modificados, y también puede analizar el número de copias de secuencias insertadas exógenas. Es actualmente un método de caracterización molecular comúnmente utilizado.

El principal proceso de operación es el siguiente:

(2) Caracterización molecular de organismos genéticamente modificados basada en secuenciación de captura

La denominada secuenciación de captura se refiere al uso de sondas (diseñadas en base en la secuencia conocida del vector de transformación) para capturar Una tecnología en la que los fragmentos de ADN objetivo se fragmentan y secuencian después de que se enriquecen los fragmentos de ADN genómico.

La secuenciación por captura de ADN-T es una tecnología que utiliza secuencias límite de ADN-T como sondas para capturar la región de unión entre el ADN-T y el genoma, y ​​luego obtiene información de inserción de fragmentos de ADN exógenos mediante secuenciación. La longitud de la sonda es generalmente de 70 pb y el extremo 5' está biotinilado.

La secuenciación de captura SBS (Southern by sequencing) consiste en diseñar una serie de sondas marcadas basadas en la secuencia de ADN del vector de transformación, utilizar estas sondas para hibridar con fragmentos de ADN del genoma receptor y secuenciar los fragmentos capturados. Fragmentos de ADN. Analizar la secuencia de la región de unión para determinar la información de inserción del gen extraño.

6. Resumen

La tecnología de secuenciación de alto rendimiento tiene las características de alto rendimiento, bajo costo, estandarización y alta precisión. Se ha utilizado ampliamente en la caracterización molecular de. organismos genéticamente modificados y los datos de secuenciación han sido reconocidos por los Estados Unidos, la Unión Europea, Canadá y otros países para la evaluación de la seguridad de los organismos genéticamente modificados. En la actualidad, con el apoyo de muchos años de importantes proyectos nacionales especiales para el cultivo de nuevas variedades de organismos genéticamente modificados, constantemente surgen nuevos cultivos genéticamente modificados, como rasgos compuestos, ARNi y edición de genes, lo que ha traído nuevos desafíos a la caracterización molecular. Tecnología de cultivos genéticamente modificados. Es una tendencia inevitable aplicar tecnología de secuenciación de alto rendimiento a la caracterización molecular de organismos genéticamente modificados en mi país y utilizar datos de secuenciación para la evaluación de la seguridad de los organismos genéticamente modificados.