Introducción a la tecnología de secuenciación de alto rendimiento y sus principios
La tecnología de secuenciación de alto rendimiento y sus principios se presentan a continuación:
1. ¿Qué es la secuenciación de alto rendimiento?
La tecnología de secuenciación de alto rendimiento también se denomina La secuenciación de próxima generación (NGS) es relativa a la secuenciación de Sanger. Dado que la aparición de la secuenciación de alto rendimiento permite analizar de forma exhaustiva y cuidadosa el genoma y el transcriptoma de las especies, también se denomina secuenciación profunda (dessecuenciación). La aparición de la tecnología de secuenciación de alto rendimiento permite analizar de forma exhaustiva y detallada el genoma y el transcriptoma de una especie, por lo que también se denomina secuenciación profunda.
La secuenciación de alto rendimiento se caracteriza por la capacidad de secuenciar cientos de miles a millones de moléculas de ADN en paralelo al mismo tiempo, y la longitud de lectura es generalmente corta, es decir, se leen y se leen múltiples fragmentos cortos de ADN. Empalmado en una secuencia completa de información. En comparación con el método de secuenciación Sanger de primera generación, la tecnología de secuenciación de alto rendimiento tiene ventajas obvias en el procesamiento de muestras a gran escala, tiene una posición insustituible en términos de velocidad de secuenciación y rendimiento de secuenciación, y es la tecnología central en la investigación histológica actual.
2. Principio
El ADN genómico se fragmenta y se clona en un vector plásmido, para luego transformarse en E. coli. Cada ciclo de la reacción de secuenciación contiene los cuatro trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTP) para la amplificación y una pequeña cantidad de un trifosfato de didesoxinucleótido diferente (ddNTP) para la terminación. Dado que los ddNTP no contienen grupos hidroxilo en los extremos 2' y 3', no se pueden formar enlaces fosfodiéster durante la síntesis de ADN.
Por lo tanto, se puede añadir una cierta proporción de ddNTP marcados con radioisótopos (divididos en ddATP, ddCTP, ddGTP y ddTTP) a los cuatro sistemas de reacción de síntesis de ADN respectivamente para interrumpir la reacción de síntesis de ADN y formar el oligoelemento extendido. Los nucleótidos terminan selectivamente en G, A, T o C y producen un marcador fluorescente.
El resultado final es un conjunto de productos de terminación de cadena, con una longitud que oscila entre unos pocos cientos y unos miles de bases, que comienzan en el mismo lugar pero terminan en nucleótidos diferentes. A partir de la posición de las bandas electroforéticas tras la electroforesis en gel y la radiografía se puede determinar la secuencia de ADN de la molécula a detectar.