Introducción a la detección de drogas de alto rendimiento

1. Biblioteca de muestras de compuestos

Las muestras de compuestos provienen principalmente de dos fuentes: síntesis artificial y separación y purificación a partir de productos naturales. Entre ellos, la síntesis artificial se puede dividir en dos métodos: síntesis química convencional y síntesis química combinatoria.

2. Sistema operativo automatizado

El sistema operativo automatizado utiliza una computadora para controlar todo el proceso experimental a través de un software operativo. El software operativo utiliza imágenes físicas para representar equipos experimentales e ilustraciones concisas y claras para representar las acciones de la máquina. La capacidad de trabajo del sistema operativo automatizado depende de los componentes del sistema. Los equipos como muestreo, lavado, termólisis, centrifugación, etc. se pueden configurar según sea necesario para realizar el trabajo correspondiente.

3. Sistema de detección de alta sensibilidad

Los sistemas de detección utilizan generalmente contadores de centelleo de líquidos, contadores de detección de quimioluminiscencia, espectrofotómetros de banda ancha, fotómetros de fluorescencia, etc.

4. Sistema de gestión de bases de datos

El sistema de gestión de bases de datos realiza cuatro funciones: función de gestión de biblioteca de muestras; función de gestión de información de actividad biológica; función de detección de fármacos de alto rendimiento; Funciones de descubrimiento. Los modelos de detección más utilizados son a nivel molecular y celular. Observan la interacción entre fármacos y objetivos moleculares y pueden comprender directamente el mecanismo de acción básico de los fármacos.

1. Modelos de detección de fármacos a nivel molecular: modelo de detección de receptores; modelo de detección de enzimas; modelo de detección de canales iónicos.

1.1 Modelo de detección de receptores: se refiere al modelo de unión de receptores a ligandos radiactivos. . Los métodos de detección que se dirigen a los receptores incluyen diferentes tipos, como la detección de respuestas funcionales, la producción de segundos mensajeros y la interacción entre ligandos y receptores marcados.

1.2 Modelo de screening enzimático: observar el efecto de los fármacos sobre la actividad enzimática. Según las características de la enzima, el sustrato de reacción y el producto de la enzima se pueden utilizar como indicadores de detección y la velocidad de reacción se puede determinar en consecuencia. La detección de enzimas típica incluye 1) incubación en un tampón apropiado (2) controlar la velocidad de reacción, como la temperatura, el valor de pH del tampón y la concentración de enzima (3) un contador de punto de tiempo único, que debe medir el aumento y el fondo de la enzima; El producto. Reducción de las cosas.

1.3 Modelo de detección de canales iónicos: (1) Detección de alto rendimiento de toxinas de mariscos, el objetivo es el sitio de unión de la saxitoxina en el canal de Na y se realiza una prueba de unión competitiva con ligandos radiactivos. Examine la muestra de prueba. . (2) Utilice el método de dos híbridos de levadura para detectar moléculas pequeñas de alto rendimiento que interfieren con la interacción entre la subunidad β3 del canal de calcio tipo N y la subunidad α1β para encontrar nuevos antagonistas de los canales de calcio.

2. Modelo de detección de drogas a nivel celular

Observa los efectos de las muestras analizadas en las células, pero no puede reflejar las vías y objetivos específicos de los efectos de las drogas, solo refleja los efectos. de medicamentos sobre el crecimiento celular y otros procesos. Incluyendo: Activación de células endoteliales; Apoptosis; Actividad antitumoral; Detección de regulación transcripcional; Vías de transducción de señales; Crecimiento bacteriano;

La tecnología de detección de alto rendimiento tiene las siguientes ventajas en comparación con los métodos tradicionales de detección de fármacos: pequeño volumen de reacción; detección rápida y sensible y alta especificidad; Sin embargo, la detección de alto rendimiento como método de detección de fármacos no es un método universal. En primer lugar, la detección de alto rendimiento utiliza principalmente modelos experimentales in vitro a nivel molecular y celular. Ningún modelo puede reflejar completamente las características integrales de un fármaco. efectos farmacológicos; en segundo lugar, los modelos utilizados para la detección de alto rendimiento son limitados y están en constante evolución, y no es realista establecer un modelo ideal que refleje todas las funciones fisiológicas del cuerpo. Pero debemos creer que con la profundización de la investigación de detección de alto rendimiento, con la unificación de los criterios de evaluación de los modelos de detección, el descubrimiento de nuevos objetivos farmacológicos y la novedad y practicidad de los modelos de detección, la tecnología de detección de alto rendimiento lo hará. Seguramente desempeñarán un papel cada vez más importante en la futura investigación farmacológica. Tecnología de medición óptica. Investigadores de los Estados Unidos y el Reino Unido han trabajado arduamente para estudiar métodos de medición óptica en la detección y detección de alto rendimiento, y han establecido una gran cantidad de ensayos de etiquetado no isotópicos, como el uso de métodos de detección espectrofotométricos para detectar inhibidores de la proteína tirosina quinasa. El activador de lisinógeno de fibra tisular, etc., han tenido éxito.

Tecnología de detección de radiactividad.

En una investigación de detección de drogas de alto rendimiento, el académico estadounidense Ganie SM aplicó ensayos radiactivos, especialmente métodos de detección de afinidad de centelleo (SPA), para desarrollar experimentos de volumen de muestra en placas de 96 pocillos. Este método tiene una alta sensibilidad y especificidad, lo que promueve la realización de pruebas de detección de fármacos de alto rendimiento, pero presenta problemas de contaminación ambiental.

Tecnología de detección de fluorescencia. El académico estadounidense GiulianokA cree que el método de detección de fluorescencia FLIPR (lectura de imágenes fluorométricas) puede medir simultáneamente la intensidad y los cambios de la fluorescencia en poco tiempo, y es útil para medir el flujo de iones de calcio intracelular, el pH intracelular y el flujo de iones de sodio intracelular. Método de detección muy ideal y eficiente.

Sistema de detección de microplacas multifuncional. El sistema de detección de microplacas multifuncional de alto rendimiento con placa de 1536 pocillos desarrollado por la Facultad de Farmacia de la Universidad Xi'an Jiaotong es un sistema de detección de alto rendimiento avanzado internacionalmente que puede aumentar aún más la capacidad de detección y ahora se ha puesto en uso en el. hospital.

1. Principios básicos

La tecnología de detección de drogas de alto rendimiento es un nuevo sistema técnico formado mediante la combinación orgánica de múltiples métodos técnicos. Se basa en métodos experimentales a nivel molecular y celular, y utiliza el formato de microplaca como experimento. El portador de herramientas utiliza un sistema operativo automatizado para ejecutar el proceso experimental, utiliza instrumentos de detección rápidos y sensibles para recopilar datos experimentales y utiliza computadoras para analizar y procesar los datos obtenidos del experimento. Su desarrollo normal requiere una biblioteca de compuestos de alta capacidad, un sistema operativo automatizado, un sistema de detección altamente sensible, un sistema de procesamiento de datos eficiente y un modelo de detección de drogas altamente específico.

1.1 Biblioteca de muestras de compuestos

El cribado de alto rendimiento es un cribado aleatorio in vitro que utiliza compuestos existentes. Por lo tanto, la eficacia de descubrir compuestos líderes mediante la detección de fármacos de alto rendimiento depende de la cantidad y la calidad de los compuestos en la biblioteca de muestras de compuestos. El número de muestras compuestas se refiere al número de muestras diferentes. La calidad de las muestras compuestas está determinada principalmente por la diversidad de estructuras compuestas. Muchos grupos reactivos aumentan significativamente la cantidad de falsos positivos en la detección inicial y la eliminación de estos compuestos puede mejorar la calidad de la biblioteca de muestras de compuestos.

Las muestras de compuestos proceden principalmente de dos fuentes: síntesis artificial y separación y purificación a partir de productos naturales.

La síntesis artificial se puede dividir en dos métodos: síntesis química convencional y síntesis química combinatoria. Los compuestos puros sintetizados mediante química convencional siempre han sido la principal fuente para que las empresas farmacéuticas extranjeras establezcan bibliotecas de muestras de compuestos. Han construido una biblioteca de muestras compuestas a partir de compuestos acumulados durante muchos años y han mejorado enormemente la cantidad y calidad de la biblioteca de muestras compuestas mediante la compra y el intercambio de compuestos.

La aparición de la química combinatoria proporciona otra fuente para aumentar considerablemente el número de compuestos. El principio básico de la química combinatoria es utilizar métodos químicos apropiados para agregar diferentes grupos a un núcleo molecular específico para producir una gran cantidad de nuevos compuestos en las mismas condiciones. Este método ha mostrado grandes ventajas en la modificación estructural y optimización de compuestos. Sin embargo, dado que este método se basa en la transformación de la estructura central original, la gran cantidad de compuestos producidos todavía tiene grandes deficiencias en cuanto a diversidad estructural. Resolver el problema de la diversidad estructural de productos químicos combinatorios se ha convertido en un tema de investigación para los investigadores químicos.

En el caso de los compuestos aislados de productos naturales, sus estructuras centrales y grupos activos se forman mediante selección natural a largo plazo, y sus actividades biológicas demostradas mediante análisis de alto rendimiento tienen el potencial de sintetizarse artificialmente en el descubrimiento de fármacos. Ventajas que los compuestos no pueden igualar. Por lo tanto, aumentar la diversidad estructural de los compuestos naturales y sus derivados en la biblioteca de muestras es una forma importante de mejorar la calidad de la biblioteca de muestras. Para aumentar la tasa positiva de detección de alto rendimiento, las compañías farmacéuticas multinacionales han ayudado o están tratando de ayudar a comprar monómeros de productos naturales de mi país.

1.2 Sistema operativo automático

La detección de drogas de alto rendimiento requiere analizar miles de muestras químicas todos los días. El trabajo es aburrido, los pasos son únicos y las operaciones manuales son propensas a fatiga y fatiga. errores.

El sistema operativo automatizado utiliza microplacas como recipientes de reacción con un patrón de distribución fijo (formato); las diferentes microplacas están marcadas mediante códigos de barras. El sistema operativo automatizado opera una posición específica en una microplaca específica a través de un lector fotoeléctrico y almacena los resultados de la operación y los datos relacionados en la computadora, lo que hace que los resultados de la detección sean precisos y el proceso experimental sea rápido.

El proceso de programación automatizada del sistema operativo es conciso, claro y altamente operable. La capacidad de trabajo del sistema operativo automatizado depende de los componentes del sistema. Los equipos como muestreo, lavado, termólisis, centrifugación, etc. se pueden configurar según sea necesario para realizar el trabajo correspondiente.

Además de la necesidad de pasos experimentales, la adición automatizada de muestras es un factor importante que determina la velocidad de detección. Existen principalmente varios métodos, como orificio único, 8 orificios, 96 orificios, 384 orificios, etc. Los orificios individuales se utilizan generalmente para la transferencia de muestras de control y muestras dispersas en el recribado. Los modelos de detección y detección de actividad enzimática que necesitan iniciar y detener reacciones al mismo tiempo son necesarios de 96 y 384 pocillos.

Un componente importante del sistema operativo automatizado es la pila (hotel). La denominada pila se refiere al espacio móvil necesario para colocar placas de muestra y placas de reacción y transferirlas durante la operación. Por lo tanto, la cantidad de muestras para el cribado de alto rendimiento depende de la capacidad de la pila.

Se puede observar que el sistema operativo automatizado para la detección de drogas de alto rendimiento consta de cuatro partes: una computadora y su software operativo, un equipo de muestreo automatizado, un equipo de incubación y centrifugación, y una pila. Diferentes unidades pueden elegir e integrar diferentes partes en un sistema operativo completo según el tipo de modelo de cribado principal y la escala de cribado.

Sistema de detección 1.3

La tecnología de detección rápida y altamente sensible es una de las tecnologías clave para la detección de drogas de alto rendimiento. Con la mejora continua de la sensibilidad de los instrumentos de detección, se pueden obtener buenos resultados de detección incluso para la detección de muestras traza.

1.3.1 Recuento de centelleo líquido Los isótopos radiactivos se utilizan ampliamente en ensayos de unión a receptores, citotoxicidad, experimentos de proliferación celular, trazadores del metabolismo de fármacos y análisis genéticos. Debido al uso de tubos fotomultiplicadores duales y tecnología de circuito de coincidencia resuelta en el tiempo, la interferencia de las señales de fondo se reduce efectivamente, se mejora la sensibilidad de la medición y se reduce la cantidad de isótopos. En el análisis y detección de placas de 96 pocillos, la señal de fondo se puede controlar en aproximadamente 10 cpm.

El ensayo de proximidad de centelleo (SPA) es un nuevo método de análisis de centelleo líquido. Este método se utiliza comúnmente en la detección de fármacos receptores de la superficie celular. Para la detección de alto rendimiento de la unión por afinidad del receptor de la superficie celular, los ensayos de filtración marcados con radioligando se han reemplazado por ensayos de centelleo de afinidad debido a la separación requerida. La tecnología de análisis de centelleo por afinidad une ligandos radiactivos a esferas de centelleo con receptores mediante unión por afinidad, generando así fotones, lo que reduce el proceso de separación de ligandos libres y ligandos unidos en el análisis de etiquetado de radioligandos, lo que hace que el análisis de ligandos radiactivos se pueda realizar de forma totalmente automatizada, haciendo Es adecuado para la detección de alto rendimiento. Se pueden utilizar isótopos que producen partículas radiactivas de baja energía para el radiomarcado, y estas partículas radiactivas de baja energía se pueden reabsorber en distancias cortas para garantizar que solo se detecten los ligandos unidos a la superficie del receptor. La tecnología SPA se utiliza ampliamente en el análisis de quinasas, enzimas procesadoras de ácidos nucleicos y análisis de interacción receptor-ligando.

1.3.2 Espectrofotometría Para adaptarse a la detección de fármacos de alto rendimiento, muchas empresas han producido espectrofotómetros con interfaces de computadora que pueden detectar placas de múltiples pocillos simultáneamente. Tomemos como ejemplo el espectro 190 de Molecular Device. Utiliza 8 fibras ópticas para medir 8 pozos al mismo tiempo. La longitud de onda de medición se realiza en intervalos de 2 nm y se puede seleccionar entre 190 nm y 850 nm. Para una sustancia desconocida, se puede realizar una exploración dentro de este rango para determinar su espectro de absorción característico. Por lo tanto, la diversidad en la construcción de modelos aumenta considerablemente. Los datos de detección se generan en diferentes formatos de archivo y se pueden procesar con software aleatorio o software de procesamiento de datos general. Cómodo, rápido, preciso y altamente automatizado.

La conexión entre instrumentos espectrofotométricos de alta sensibilidad y sistemas operativos automatizados ha hecho que los modelos de detección de drogas de alto rendimiento basados ​​en espectroscopia ultravioleta y visible sean el principal tipo de modelo.

1.3.3 Detección de quimioluminiscencia La quimioluminiscencia se refiere a la liberación de energía química en forma de fotones bajo la acción enzimática de sustancias cromogénicas. La quimioluminiscencia se divide en luminiscencia luminosa y flash según la forma y el tipo de luminiscencia. Quimioluminiscencia de tipo resplandor, como reacciones de luminiscencia basadas en AMPPD, CDPS, ECL, Diagoxigein, etc. Su tiempo luminoso es largo y estable. La reacción luminiscente que utiliza proteína luminiscente, ATP, luciferasa, etc. como sustratos es una reacción luminiscente de tipo flash y su tiempo de luminiscencia es corto. Debido al uso de resolución temporal y tecnología de bucle de acoplamiento, la eliminación del fondo es más eficaz, lo que hace que la sensibilidad de detección de la quimioluminiscencia alcance el orden de 0,1 pg. En la tecnología de chorro multipunto de un solo orificio, el extremo de la fibra óptica utilizada para detectar quimioluminiscencia está equipado con una boquilla para agregar sustratos reactivos. El sustrato reactivo se rocía desde 100 pequeños orificios, de modo que el sustrato reactivo se pueda mezclar uniformemente después de agregarlo al orificio. Una vez iniciada la reacción de luminiscencia al mismo tiempo, la medición se puede realizar inmediatamente, lo que es más ventajoso para la medición de la quimioluminiscencia instantánea.

1.3.4 Detección de fluorescencia de excitación Basado en el instrumento tradicional, el nuevo detector de fluorescencia de excitación reemplaza el espectro fijo con un espectro de medición de armónicos de luz de excitación continua, haciendo más flexible el establecimiento del modelo. Los métodos de detección de fluorescencia son sensibles porque la mayoría de los fluoróforos tienen vidas medias cortas y se puede obtener una gran cantidad de flujo de fotones incluso con una fuente de luz de excitación débil. Esta característica, así como la variedad de modos de fluorescencia que se pueden utilizar, hacen de la tecnología de detección de fluorescencia un método de aplicación indispensable para la detección de alto rendimiento. Las técnicas de fluorescencia se utilizan ampliamente en análisis de detección homogéneos. Entre ellas, se incluyen tecnologías como la transferencia de energía de fluorescencia (FRET), la polarización de fluorescencia (FP), la fluorescencia resuelta en el tiempo (TRET) y la espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS).

1.4 Sistema de gestión de bases de datos

La detección de fármacos de alto rendimiento se caracteriza por la detección multimodelo de decenas de miles de muestras compuestas. El sistema de gestión de bases de datos adecuado para la detección de drogas de alto rendimiento realiza principalmente cuatro funciones.

La función de gestión de la biblioteca de muestras: la biblioteca de muestras compuestas almacena y gestiona diversas propiedades físicas y químicas de las muestras compuestas para la detección de fármacos de alto rendimiento. Realice análisis de novedad en cada compuesto recién agregado para excluir compuestos con estructuras similares y evitar exámenes innecesarios. Dado que los grupos altamente reactivos aumentan la probabilidad de falsos positivos, la biblioteca de muestras realiza pruebas genéticas reactivas en los compuestos recién agregados para eliminarlos.

Función de gestión de información de actividad biológica: la biblioteca de actividad biológica almacena los resultados de cada compuesto probado por diferentes modelos y evalúa exhaustivamente la actividad biológica del compuesto en función de los resultados de las pruebas de múltiples modelos.

Funciones de servicio para la detección de drogas de alto rendimiento: la detección de drogas de alto rendimiento requiere una gran carga de trabajo, un alto grado de automatización y también implica mucho trabajo tedioso. El sistema de gestión de bases de datos de detección de drogas de alto rendimiento gestiona las comunicaciones comerciales, la gestión de archivos y la impresión de varias etiquetas de muestra relacionadas con la detección de drogas, para programar y estandarizar todos los aspectos de la detección de drogas de alto rendimiento.

Funciones de diseño y descubrimiento de fármacos: la detección de fármacos de alto rendimiento genera una gran cantidad de información estructural del compuesto. A medida que avanza la detección, la información de la actividad biológica también aumenta significativamente. El sistema de gestión de bases de datos de detección de fármacos de alto rendimiento analiza las estructuras de diferentes compuestos que muestran reacciones positivas en el mismo modelo para descubrir sus relaciones estructura-actividad, proporcionando así una referencia para el diseño de fármacos.

1.5 Modelo de cribado

Se refiere al método experimental utilizado para detectar los efectos de las drogas. Dado que la detección de alto rendimiento requiere un volumen de reacción total pequeño y la reacción tiene alta especificidad y sensibilidad, los requisitos para el modelo de detección también son altos. Estos modelos se centran en receptores, enzimas, canales y diversas respuestas celulares. Los modelos de detección de drogas a nivel genético amplían el alcance de los modelos de detección de drogas.

1.5.1 Detección de alto rendimiento dirigida a enzimas La mayoría de los métodos de detección de alto rendimiento dirigidos a enzimas detectan directamente la actividad enzimática.

Los métodos específicos varían según las diferentes enzimas y hay dos categorías principales: métodos basados ​​en radiactividad y métodos colorimétricos y basados ​​en fluorescencia.

Los métodos basados ​​en la radiactividad etiquetan principalmente sustratos y miden la producción de productos radiactivos. Taft et al. establecieron un método de detección de alto rendimiento para inhibidores de la (1,3) β-glucano sintasa (antifúngicos). Añadir extracto de micelio que contiene enzima, α-amilasa y UDP-14C-glucosa en los pocillos de una placa de 96 pocillos, incubar y reaccionar. Después de terminar la reacción, filtrar el sustrato no sintetizado. El recuento de centelleo detecta el (1,3)β-glucano retenido en el filtro, lo que indica la cantidad de actividad enzimática.

También existen métodos para marcar enzimas y medir las enzimas unidas específicamente. Vollmer et al. establecieron un método de detección de alto rendimiento para antibióticos dirigidos a la proteína fijadora de penicilina (PBP). PBP es tanto una glicosiltransferasa como una peptidiltransferasa, y este método consiste en detectar sustancias que se pueden unir en el sitio activo de su dominio de transferencia de glicosilo. Combine moenomicina (moenomicina) en un pellet para hacer una suspensión, agréguela a una placa de 96 pocillos, luego agregue PBP (extracto crudo de membrana bacteriana) marcada con 3H y el compuesto de prueba, incube y filtre para eliminar sustancias no tóxicas. La radioactividad unida, medida mediante recuento de centelleo, indica la unión de PBP a la monomicina y el efecto del compuesto de prueba sobre ella.

Además también se utiliza SPA basado en radiactividad sin separación por filtración. Brown et al. establecieron un método de detección de la actividad hidrolítica de peptidasas endógenas para estudiar sus inhibidores. El sustrato peptídico marcado con 3H está conectado a la esfera de centelleo SPA recubierta con avidina a través de biotina. La hidrólisis enzimática hace que el 3H abandone la esfera de centelleo junto con la escisión del péptido. Se mide la pérdida de señal de centelleo producida por la acción de la radiactividad 3H sobre la esfera de centelleo, lo que indica la actividad de la enzima.

Existen algunos informes sobre métodos basados ​​en colorimetría, fluorescencia, etc. Waslidge et al. establecieron un método de detección de inhibidores de la lipoxigenasa. En condiciones ácidas, el peróxido lipídico puede oxidar Fe2 a Fe3 y luego oxidar el naranja de xilenol. El producto tiene una fuerte absorción en la región de luz visible de 620 nm. Ensayado en placas de 96 pocillos. Zhang et al. establecieron un método de detección de alto rendimiento para los inhibidores de la transcriptasa inversa del VIH (fármacos antivirales). El método utiliza tecnología de "fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo" (HTRF), que no solo logra una operación sin separación (homogénea), sino que también evita el uso de isótopos radiactivos. El método se basa en la capacidad de la transcriptasa inversa para introducir fácilmente análogos de nucleótidos (como la biotina-11-dUTP) en cadenas de ADN nacientes. En una placa de 96 o 384 pocillos, mezcle el cebador/plantilla biotinilado con estreptavidina-europio en los pocillos e incúbelo, agregue la transcriptasa inversa y luego agregue la mezcla de biotina-dUTP y d-TTP para iniciar la reacción. Después de reaccionar durante 60 minutos, agregue estreptavidina-aloficocianina, incube y lea los datos con un analizador HTRF. Este método también se puede utilizar con una variedad de otras polimerasas de ácidos nucleicos.

1.5.2 Cribado de alto rendimiento dirigido a receptores. Métodos de cribado de alto rendimiento dirigido a receptores. La ventaja de detectar respuestas funcionales es que es fácil distinguir entre agonistas y antagonistas. Los métodos de detección funcional clásicos tienen un rendimiento bajo y la introducción de métodos de detección de genes informadores basados ​​en tecnología recombinante ha mejorado enormemente el rendimiento de la detección, lo que es eficiente y ahorra costos. Los métodos tradicionales para detectar segundos mensajeros o mecanismos posteriores, como la fosforilación, también son engorrosos y no adecuados para la detección de alto rendimiento, pero acoplar estos mecanismos a genes informadores puede superar este problema.

1.5.3 Detección de alto rendimiento dirigida a canales iónicos Negri et al. establecieron un método de detección de alto rendimiento para toxinas de mariscos. Su objetivo es el sitio de unión de la saxitoxina (STX) en el canal de Na, y se usó un ligando radiactivo (3H-STX) para realizar una prueba de unión competitiva para examinar la muestra de prueba. Yong et al. utilizaron un método de dos híbridos de levadura para detectar moléculas pequeñas de alto rendimiento que interfieren con la interacción entre la subunidad β3 y la subunidad α1β de los canales de calcio de tipo N para buscar nuevos antagonistas de los canales de calcio.

1.5.4 Detección de alto rendimiento dirigida a ácidos nucleicos Hamasaki et al. establecieron un método de detección de alto rendimiento para inhibidores dirigidos a la estructura de la región codificante del ARNr 16S y la estructura del ARN del VIH-RRE. Busque nuevos compuestos que sean similares a los antibióticos aminoglucósidos pero que tengan mayor afinidad o actúen en otros sitios del mismo ácido nucleico, así como nuevos compuestos que no sean fácilmente inactivados por el metabolismo. El método se basa en el principio de que cuando los análogos de aminoglucósidos que contienen pireno se unen al ARN, se apaga la fluorescencia del pireno. En una placa de 96 pocillos, prepare una solución de pirencarbonilparomomicina (PCP) y estructura de ARN y agréguela al pocillo de la placa que contiene el compuesto de prueba y utilice un lector de placas de fluorescencia para examinar el grado de recuperación de la fluorescencia.

1.5.5 Detección de alto rendimiento basada en la función celular

1.5.5.1 Activación de las células endoteliales La activación de las células endoteliales es un componente importante en el proceso de inflamación aguda y crónica. Rice et al. utilizaron la expresión de E-selectina en la superficie celular como marcador para establecer un método de detección de alto rendimiento para inhibidores de la activación de células endoteliales. Establecimiento de un sistema de cultivo de células endoteliales de la vena umbilical humana. Bajo estimulación con IL-1, se cuantificó mediante ELISA la expresión de E-selectina en la superficie de las células endoteliales. El método incluye operaciones como la fijación de células, la adición de líquido y la adición de compuestos de prueba. Puede mantener las células intactas, es económico, repetible y puede detectar hasta 1.000 compuestos por semana. La gama de compuestos aplicables es muy amplia y el método utiliza células como objeto de detección, lo que permite el descubrimiento temprano de la absorción de compuestos por las células y la citotoxicidad de los compuestos.

1.5.5.2 Apoptosis Erusalimsky et al. establecieron un método de detección de alto rendimiento para nuevos reguladores de la apoptosis. Las células se marcaron previamente con 3H timidina y, después de la incubación con inductores de apoptosis, se pasaron continuamente a través de dos tipos de filtros de vidrio. Uno es neutro y captura cromatina intacta y ADN de alto peso molecular. El otro está equipado con un grupo activo DEAE que captura fragmentos de ADN de bajo peso molecular. Midiendo la radiactividad en el filtro, se puede cuantificar la fragmentación del ADN.

1.5.5.3 Actividad antitumoral Lu et al. establecieron un método para detectar medicamentos contra el cáncer de pulmón utilizando "huellas dactilares de bioactividad" de alto rendimiento para examinar los efectos de las moléculas de prueba (retinoides y moléculas relacionadas con los retinoides). ) sobre muchas características de efecto de diferentes líneas celulares. Los indicadores de detección incluyen: (1) Detección de inhibición del crecimiento de células de cáncer de pulmón. Se seleccionaron aproximadamente 50 tipos de células tumorales y no tumorales, que abarcan una gran cantidad de tejidos y/o fuentes tumorales diferentes. Después de que las células se expusieron al compuesto de prueba durante 5 días, se determinó el porcentaje de células viables usando un método colorimétrico estándar. Una tasa de inhibición del crecimiento de 20 indica actividad. (2) El ensayo de inhibición de la formación de colonias se utiliza para distinguir la inhibición del crecimiento celular y la destrucción celular. Se agregaron células de cáncer de pulmón de células no pequeñas NCI-H292 a la placa de 6 pocillos y se expusieron a la sustancia de prueba durante un período de tiempo determinado. Luego las células se lavaron y se trasplantaron a medio de cultivo sin sustancia de prueba durante 7 días. Las células se tiñeron con cristal violeta para observar la formación de colonias. (3) Detección de apoptosis, mediante el método ELISA para medir la fragmentación del ADN celular. (4) La detección de la regulación transcripcional se utiliza para examinar si el compuesto de prueba tiene inhibición transcripcional mediada por el receptor de retinoides. El método consiste en transfectar células HeLa TK con el gen indicador 73Col-CAT junto con el vector de expresión del receptor, cultivarlas junto con la sustancia de prueba y utilizar el método ELISA para detectar la actividad CAT.

1.5.5.4 Punto de control G2 Roberge et al. establecieron un método de detección de alto rendimiento para inhibidores del punto de control G2. Se cultivaron células MCF-7m p53 y se sembraron en placas de cultivo de tejidos de poliestireno de 96 pocillos. La irradiación hace que las células entren en la fase estacionaria G2 y se agrega el compuesto de prueba para detectar la forma fosforilada de nucleolina (nucleolina) usando ELISA para obtener el número de células liberadas de la fase G2 a la fase M, es decir, el grado de inhibición del punto de control G2.

1.5.5.5 Vía de transducción de señales Su et al. establecieron un método de detección de alto rendimiento para los interactuantes de la vía TGFβ3. Construya un gen indicador de fusión, transfecte células y seleccione clones cuya expresión de luciferasa pueda ser altamente inducida por TGFβ.

Las células se plantaron en una placa de 96 pocillos y, después de la incubación con el compuesto de prueba, las células se diluyeron y se añadió sustrato Steady-Glo para medir la actividad de la luciferasa. En comparación con el control, se calculó el aumento relativo de la actividad enzimática.

1.5.5.6 Secreción de proteínas bacterianas Alksne et al. establecieron un método de detección de alto rendimiento para nuevos antibióticos que inhiben la secreción de proteínas bacterianas como modo de acción. Este método se basa en el gen indicador de fusión SecA-lacZ. SecA es una proteína que autorregula la traducción. Cuando se altera la secreción de proteínas bacterianas, se induce el gen informador.

1.5.5.7 Crecimiento bacteriano Chung et al. establecieron un método de detección de alto rendimiento para compuestos que inhiben el crecimiento de micobacterias. Se eligió una micobacteria saprofita en lugar de M. tuberculosis debido a su rápido crecimiento y su naturaleza no infecciosa. Se investigó el efecto del compuesto de prueba sobre la viabilidad de las micobacterias midiendo la absorción celular de uracilo radiomarcado. Utilizando un formato de placa de 96 pocillos, se pueden analizar miles de muestras en 1 día.

2． Detección de alto rendimiento de ingredientes activos de medicamentos crudos

Las muestras son la base material para la detección de fármacos de alto rendimiento La diversidad química de las fuentes de la biblioteca de muestras es uno de los factores clave que determinan el éxito del análisis de alto rendimiento. tecnología de detección. Como mencionamos anteriormente, las muestras de compuestos provienen principalmente de varias fuentes: síntesis química convencional, síntesis química combinatoria y aislamiento y purificación de productos naturales. Los compuestos aislados de productos naturales tienen ventajas que los compuestos sintéticos no pueden igualar porque su estructura central y sus grupos activos se forman mediante selección natural a largo plazo.

Nuestro país tiene recursos medicinales muy ricos. Durante las últimas décadas, hemos aplicado métodos farmacológicos para realizar investigaciones y exámenes a gran escala de las medicinas tradicionales de mi país y hemos logrado grandes logros. Sin embargo, depender únicamente de métodos experimentales farmacológicos tradicionales requiere mucho tiempo, trabajo y el uso de una gran cantidad de animales de experimentación. Obviamente, no es adecuado para la detección simultánea de una gran cantidad de muestras. Aunque se ha aislado, extraído y purificado una gran cantidad de compuestos a partir de drogas crudas mediante un arduo trabajo, debido a métodos de investigación atrasados, una gran cantidad de compuestos aislados no se pueden utilizar por completo, lo que resulta en un enorme desperdicio de recursos compuestos.

Por lo tanto, aplicar tecnología de detección de alto rendimiento al estudio de ingredientes activos de medicamentos crudos no es solo una mejora continua de la tecnología de detección de alto rendimiento, sino también un intento útil de aplicar esta tecnología a la investigación moderna sobre medicina tradicional china.

¿Cómo realizar una detección de alto rendimiento de los ingredientes activos de medicamentos crudos? Sus principios y métodos son básicamente los mismos que los del cribado de alto rendimiento de compuestos sintéticos. La principal diferencia radica en la necesidad de extraer compuestos de medicamentos crudos y realizar una separación y evaluación adecuadas de la diversidad química antes del cribado. No entraremos en detalles sobre los mismos. Aquí hablamos principalmente de los temas de extracción, separación y evaluación de la diversidad.

2.1 Extracción Dado que el cribado de alto rendimiento requiere una gran cantidad de fuentes de muestra, los métodos de extracción convencionales obviamente no pueden cumplir con este requisito. Es urgente encontrar un método de extracción rápido, eficiente, continuo y automatizado. La tecnología de extracción acelerada por solventes es una nueva tecnología de extracción después de preparar la muestra y configurar el método (o programa) de extracción, el dispositivo de muestreo y recolección automático puede completar automáticamente la extracción y extracción de hasta 24 muestras diferentes de forma continua. El líquido es simple y conveniente. Aplicando esta tecnología se puede obtener una gran cantidad de extractos de fármacos crudos.

2.2 Aislamiento y evaluación de la diversidad química Todos sabemos que la composición química de las drogas crudas es bastante compleja, y los extractos obtenidos mediante extracción suelen ser mezclas de una gran cantidad de monómeros, por lo que los extractos de las drogas crudas necesitan para ser examinado antes de la separación adecuada. Entre los muchos métodos de separación, la HPLC preparativa debería ser el más ideal, ya que tiene muchas ventajas, como velocidad, eficiencia y automatización.

Una vez completada la separación, es necesario evaluar la diversidad química de las sustancias separadas para mejorar la eficiencia del cribado de alto rendimiento. En el pasado, este tipo de evaluación se basaba principalmente en la distribución geográfica, la clasificación biológica, la clasificación química y el origen de las especies. Con el avance de la ciencia y la tecnología, se han comenzado a aplicar una variedad de métodos modernos para la evaluación de la diversidad química. . Entre ellos, la tecnología de cromatografía-espectrometría de masas por electropulverización (HPLC-ESI-MS) ha hecho un poderoso intento en este sentido.

Primero, genera una gráfica de la señal iónica del componente (m/z) versus el tiempo de retención y luego realiza una evaluación de similitud estadística de estos datos para proporcionar una evaluación cuantitativa de la diversidad de la muestra. A continuación, los datos de HPLC tridimensionales se convirtieron al formato de archivo CDF y se transfirieron a la estación de trabajo UNIX. Cada ion en el archivo de datos (incluido el tiempo de retención, la masa, la intensidad de los iones y otros datos) se coloca en un espectro bidimensional. El tiempo de retención y la masa ocupan un eje, y los datos de intensidad de los iones se almacenan en el sitio. Después de filtrar el ruido, se calculan el tiempo central y la masa central del ion. Basado en el procesamiento de datos LCMS, se calculó cuantitativamente la similitud entre mezclas. Este procesamiento de datos se basa en una relación que caracteriza la distancia del "espacio químico" entre el ion i en la muestra 1 y el ion j en la muestra 2.

Entre ellos, ti representa el tiempo de retención cromatográfica del ion i, mi representa la relación masa-carga (m/z) del ion i, wt es el coeficiente de ponderación del tiempo de retención y wm es el coeficiente de ponderación de la masa. dij es la distancia euclidiana entre el ion i y el ion j, n1 y n2 son el número de iones confirmados en la muestra 1 y la muestra 2 respectivamente. sij es la similitud (0-1) entre el ion i y el ion j. Un valor de similitud de 1 indica la misma muestra. Por el contrario, un valor de similitud cercano a 0 indica que la muestra tiene una alta diversidad química. Mediante este método, se puede resolver bien el problema de evaluar la diversidad química de muestras.