Revisar el contenido del curso optativo 3 de biología de la escuela secundaria.

1.1 Herramientas básicas de la tecnología del ADN recombinante

1. ¿Por qué las endonucleasas de restricción en las bacterias no cortan el ADN bacteriano?

Consejo: Hasta ahora, la mayoría de las enzimas de restricción utilizadas en ingeniería genética se extraen de bacterias o mohos, cada uno de los cuales puede reconocer y cortar bases específicas en la secuencia del ADN. La razón por la que las endonucleasas de restricción en las bacterias no cortan su propio ADN es porque los microorganismos han desarrollado un conjunto completo de mecanismos de defensa durante su proceso de evolución a largo plazo, que pueden degradar el ADN invasor extraño. En la evolución a largo plazo de los organismos, las moléculas de ADN de las células que contienen una determinada endonucleasa de restricción no tienen la secuencia de reconocimiento y corte de esta endonucleasa de restricción, o el grupo metilo es transferido a la base de la secuencia de reconocimiento básicamente por la metilasa. , las enzimas de restricción no pueden reducirlo. De esta forma, aunque las bacterias contienen algunas enzimas de restricción, su propio ADN no se cortará y también se puede prevenir la invasión de ADN extraño.

2. ¿Se pueden utilizar directamente moléculas de ADN naturales como vectores de ingeniería genética? ¿Por qué?

Se propone que muchas moléculas de ADN utilizadas como vectores en ingeniería genética sean plásmidos, es decir, una molécula de ADN desnuda, bicatenaria y de bucle cerrado autorreplicante e independiente del ADN pseudonuclear bacteriano. ¿Se puede utilizar cualquier plásmido como vector para la ingeniería genética? No precisamente. Como vector para la ingeniería genética, se deben cumplir las siguientes condiciones.

(1) El ADN del vector debe tener uno o más sitios de enzimas de restricción para poder insertar el gen diana en el vector. La ubicación de estas enzimas de restricción utilizadas para insertar el gen diana también debe estar fuera del segmento del gen deseado en el propio plásmido para que no se inactive mediante la inserción del gen diana.

(2) El ADN portador debe tener la capacidad de replicarse a sí mismo, o integrarse en el ADN cromosómico receptor y replicarse de forma sincrónica con la replicación del ADN cromosómico.

(3) El ADN del vector debe portar un gen marcador para que los recombinantes puedan detectarse después de la recombinación.

(4) El ADN portador debe ser seguro e inofensivo para las células receptoras, o no puede ingresar a otras células biológicas distintas de las células receptoras.

(5) El tamaño molecular del ADN portador debe ser adecuado para la extracción y las operaciones in vitro. Si es demasiado grande, será incómodo de operar.

De hecho, las moléculas de ADN plasmídico que se producen de forma natural no cumplen plenamente las condiciones anteriores y deben modificarse artificialmente antes de que puedan utilizarse en operaciones de ingeniería genética.

3. ¿La ADN ligasa tiene la capacidad de conectar ADN monocatenario?

Consejo: Ninguna de las ADN ligasas descubiertas hasta ahora tiene la capacidad de conectar ADN monocatenario. En cuanto a la razón, aún no está clara. Quizás en el futuro se descubran enzimas que puedan unir el ADN monocatenario.

4. En base a tus conocimientos, ¿puedes analizar las funciones de las enzimas de restricción en procariotas?

Se propone que los procariotas son susceptibles a la invasión de ADN extraño en la naturaleza, pero los organismos han desarrollado un conjunto completo de mecanismos de defensa en el proceso de evolución a largo plazo para prevenir la invasión de patógenos extraños. Las enzimas de restricción son las herramientas de defensa de las bacterias. Cuando el ADN extraño invade, se utilizará para cortar el ADN extraño y garantizar su propia seguridad. Por lo tanto, las endonucleasas de restricción en procariotas principalmente cortan el ADN extraño para hacerlo ineficaz y así protegerse.

5.¿La ADN ligasa y la ADN polimerasa son lo mismo? ¿Por qué?

No es lo mismo. Hay dos tipos de ligasas utilizadas en ingeniería genética: una se aísla de E. coli y se llama E? Ligasa de E. coli. El otro se aísla del bacteriófago T4 y se llama ligasa T4. Las reacciones catalizadas por estas dos ligasas son básicamente las mismas: ambas conectan muescas en el ADN bicatenario en lugar de en el ADN monocatenario. Tanto la ADN ligasa como la ADN polimerasa forman enlaces fosfodiéster, entonces, ¿cuál es la principal diferencia entre las dos?

(1)La ADN polimerasa solo puede agregar un único nucleótido al grupo hidroxilo terminal 3' de un fragmento de ácido nucleico existente para formar un enlace fosfodiéster; sin embargo, la ADN ligasa puede formar enlaces fosfodiéster en lugar de entre ellos; nucleótidos individuales y fragmentos de ADN. (2) La ADN polimerasa utiliza una hebra de ADN como plantilla para formar una hebra de ADN complementaria a la hebra plantilla a partir de un solo nucleótido a través de un enlace fosfodiéster que conecta dos espacios en las dobles hebras de ADN al mismo tiempo; Entonces la ADN ligasa no requiere una plantilla. Además, aunque todas son enzimas compuestas por proteínas, su composición y propiedades son diferentes.

6. ¿Cuáles son las condiciones para servir como “vehículo de transporte molecular”?

Consejo: puede autorreplicarse, tiene uno o más sitios de escisión, sitios de genes etiquetados y es inofensivo para las células receptoras.

7. (1) ¿Cuáles son las características de las secuencias reconocidas por las enzimas de restricción?

La secuencia reconocida por la endonucleasa de restricción, ya sea de 6 bases o de 4 bases, puede encontrar un eje central, y las bases del ADN bicatenario a ambos lados del eje central están dispuestas simétricamente y repetidamente.

(2) ¿Pueden las enzimas de restricción cortar cualquier parte del ADN?

Cualquier tipo de endonucleasa de restricción sólo reconoce y corta secuencias de nucleótidos específicas, lo cual viene determinado por la naturaleza de la endonucleasa de restricción.

(3) ¿Dónde se conecta la ADN ligasa?

La ADN ligasa conecta el grupo hidroxilo en el extremo 3' de un fragmento de ADN con el grupo hidroxilo en el extremo 5' de otro fragmento de ADN para formar un enlace éster, en lugar de conectar los enlaces de hidrógeno entre bases complementarias. .

1.2 Procedimientos operativos básicos de la ingeniería genética

1. Como vector de expresión de ingeniería genética, ¿puede completar la tarea solo conteniendo el gen objetivo? ¿Por qué?

Respuesta: No, porque el gen diana se expresa y funciona en el vector de expresión y requiere otros elementos de control, como promotores, terminadores, genes marcadores, etc. Las razones principales para construir los elementos anteriores son: (1) Para el intercambio de genes entre organismos, solo el promotor del propio gen del organismo receptor puede ser más propicio para la expresión génica (el gen objetivo obtenido de la biblioteca de ADNc no tiene un promotor; , y solo necesita codificarse Si la secuencia se introduce en el organismo receptor, no se puede transcribir (3) Si el gen objetivo se introduce en el organismo receptor requiere un marcador de detección (4) Para mejorar el nivel de expresión; del gen diana, a menudo se agregan algunos otros elementos reguladores, como potenciadores (5) A veces, para determinar dónde existe el producto de expresión del gen diana en la célula, a menudo es necesario agregar un gen que pueda marcar la parte existente ( o crear un gen de fusión del gen objetivo y el gen marcador), como el gen de la proteína verde fluorescente

2. Analizar la razón por la que Agrobacterium no puede introducir el gen objetivo en plantas monocotiledóneas. Si se quiere introducir un gen de resistencia a enfermedades en plantas monocotiledóneas, como el trigo, ¿qué se debería hacer en teoría?

¿Se propone que Agrobacterium? tumefaciens se puede dividir en Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes. En la ingeniería genética vegetal, la transformación genética mediada por plásmidos Ti de Agrobacterium tumefaciens es la más común cuando estas plantas están presentes. infectado por este hongo, Agrobacterium tumefaciens es quimiotáctico, es decir, el tejido lesionado de la planta producirá tumores. Algunos azúcares y sustancias fenólicas atraen a Agrobacterium tumefaciens a los tejidos lesionados. Los estudios han demostrado que estas sustancias se sintetizan principalmente en las paredes celulares de las dicotiledóneas. y generalmente no están presentes en las monocotiledóneas, por lo que no es fácil enraizar las monocotiledóneas. Causas de la infección por Agrobacterium tumefaciens Cuando las monocotiledóneas se infectan con Agrobacterium para la transformación genética, es necesario agregar las sustancias fenólicas mencionadas anteriormente. , los efectos de la infección por Agrobacterium sobre la transformación genética de diferentes monocotiledóneas también son muy diferentes. Para transferir un gen antiviral al trigo, también se puede utilizar Agrobacterium, pero se debe prestar atención a dos puntos: ① Seleccione la cepa de Agrobacterium adecuada, porque no todas. Las cepas de Agrobacterium pueden infectar plantas monocotiledóneas; ② Para mantener Agrobacterium cerca de la planta. En la parte lesionada del tejido (quimiotaxis), se activa el gen en la región Vir de Agrobacterium, de modo que el ADN-T se transfiere y se inserta en se debe agregar el ADN cromosómico y sustancias de inducción

3. E. coli puede producir insulina humana, considerando el conocimiento previo sobre la función de los orgánulos y la idea básica de los procedimientos de ingeniería genética. Si desea producir glicoproteínas humanas, ¿puede utilizar E. coli para generar ciertas proteínas? El péptido tiene una * * * cadena de azúcar y se procesa en el retículo endoplásmico y el complejo de Golgi que existen en las células eucariotas. Sin embargo, estos dos orgánulos no. existen en E. coli. Por lo tanto, es imposible producirlos en E. coli. La glicoproteína

4. de algunas enfermedades, como la anemia falciforme. Escherichia coli produce β-globina de ratón. ¿Cómo piensas diseñarla?

Consejos: Las operaciones básicas son las siguientes:

( 1) Clonación del gen de la β-globina de ratón. Secuencia codificante (ADNc).

(2) Preinjertar el ADNc con un promotor adecuado para E. coli y añadir un gen de resistencia a la tetraciclina para construir un vector de expresión.

(3) Introduzca el vector de expresión en E. coli libre de tetraciclina y luego cultive E. coli en un medio que contenga tetraciclina. Si el vector de expresión no ingresa a E. coli, E. coli morirá porque no contiene el gen de resistencia a la tetraciclina; si la colonia de E. coli crece en el medio de cultivo, indica que el gen de la β-globina ha ingresado.

(4) Cultivar E. coli con gen de β-globina, recolectar las bacterias, triturarlas y extraer de ellas la β-globina.

5. ¿Puedes adivinar en qué se divide aproximadamente el proceso de transcripción inversa de ARNm a ADNc?

La transcriptasa inversa puede utilizar ADN y ARN como plantillas para sintetizar cadenas de ADN complementarias. Al igual que otras ADN polimerasas, la transcriptasa inversa también sintetiza ADN en la dirección 5'→3' (Figura 1-3).

El proceso de síntesis de ADNc es el siguiente: En el primer paso, la transcriptasa inversa utiliza el ARN como plantilla para sintetizar una única hebra de ADN complementaria al ARN para formar una molécula híbrida ARN-ADN. En el segundo paso, la nucleasa H degrada la cadena de ARN de la molécula híbrida ARN-ADN, convirtiéndola en ADN monocatenario. En el tercer paso, utilizando ADN monocatenario como plantilla, se sintetiza otra cadena de ADN complementaria bajo la acción de la ADN polimerasa para formar una molécula de ADN bicatenario.

¿Qué es el proceso de amplificación del 6.6. ¿PCR?

La amplificación por PCR es un método muy útil para obtener genes diana, y también es un método muy sensible para la identificación y detección molecular. El proceso de reacción de amplificación por PCR incluye los siguientes procesos principales.

El primer paso: calentar el sistema de reacción (incluido el molde de doble cadena, los cebadores, la ADN polimerasa resistente a altas temperaturas, cuatro desoxinucleótidos, los iones necesarios para las reacciones enzimáticas, etc.) a 90 ~ 95 °C. , permitiendo abrir los enlaces de hidrógeno entre las dos hebras de la plantilla de ADN bicatenario, convirtiéndose en ADN monocatenario como plantilla para la polimerización de hebras complementarias.

Paso 2: Enfríe el sistema de reacción a 55 ~ 60 °C para hacer que los dos cebadores sean complementarios a la secuencia complementaria en el extremo 3' de la cadena de ADN plantilla, lo que se denomina renaturalización.

Paso 3: elevar la temperatura del sistema de reacción a 70 ~ 75 °C y agregar un único nucleótido complementario al molde al 3-OH proporcionado por el cebador bajo la catálisis de ADN a alta temperatura. polimerasa, extendiendo la cadena de ADN para generar una cadena de ADN que es complementaria a la cadena plantilla.

Después de completar los tres pasos anteriores, una molécula de ADN se convierte en dos moléculas de ADN. A medida que aumenta el número de repeticiones, las moléculas de ADN aumentan en la forma de 2n. El proceso de reacción de PCR se completa en un amplificador de PCR.

7. ¿Cuáles son las bandas de visualización de la tecnología de hibridación molecular?

La hibridación molecular es una tecnología comúnmente utilizada en ingeniería genética y se utiliza principalmente para la detección e identificación. Se puede dividir en hibridación entre moléculas de ácido nucleico e hibridación entre moléculas de proteínas. Las técnicas más utilizadas incluyen:

Hibridación entre ADN y moléculas de ADN. Que el gen diana esté integrado en el ADN cromosómico del organismo receptor es la clave para la existencia estable y la herencia del gen diana en organismos eucariotas. Cómo demostrar esto requiere tecnología de hibridación del Sur. El método básico es el siguiente: primero, se extrae el ADN del organismo receptor y, después de una digestión enzimática adecuada, la electroforesis en gel de agarosa separa fragmentos de diferentes tamaños; en segundo lugar, se transfieren los fragmentos de ADN del gel a una membrana de nitrocelulosa; el fragmento de ADN objetivo marcado con isótopo radiactivo (o biotina) como sonda para hibridar con el ADN en la membrana de nitrocelulosa, en el cuarto paso, presione la película de rayos X sobre la membrana de nitrocelulosa para que la película sea sensible en la oscuridad; El quinto paso es revelar la película de rayos X. Si hay una banda negra en la película negativa, significa que el ADN cromosómico de la planta receptora contiene el gen diana.

Hibridación entre moléculas de ADN y ARN. Es un método para detectar si el gen objetivo está transcribiendo ARNm. Es lo mismo que la hibridación Southern, excepto que el primer paso es extraer ARNm en lugar de ADN de la planta receptora. La apariencia de las bandas de hibridación es la misma que la hibridación Southern. .

Hibridación entre moléculas de proteínas (antígeno-anticuerpo). Es un método para detectar si el gen diana expresa proteína.

1.3 Aplicación de la ingeniería genética

1. Tabla 1-1 Relación entre organismos genéticamente modificados y genes diana

De dónde provienen los genes diana de los organismos genéticamente modificados ¿de?

Bacillus thuringiensis, gen de la proteína de la toxina Bt del algodón resistente a insectos

Gen de quitinasa de resistencia a la vaina del tabaco y gen de síntesis de antitoxinas

Tolerancia salino-álcali y resistencia a la sequía Genes en cultivos que regulan la presión osmótica celular

Gen de proteína anticongelante de tomate tolerante al frío en peces

Gen de soja resistente a herbicidas

Las frutas azucaradas pueden reducir los lácteos vacas Lactosa en el cuerpo.

Gen del sabor dulce, gen de la lactasa intestinal

Producción de insulina - gen de la insulina humana bacterias creadas por humanos

2.

El llamado uso de microorganismos para producir fármacos proteicos se refiere a la construcción de un determinado gen codificador de proteínas que necesitan los humanos en un vector de expresión, luego lo introduce en los microorganismos y luego los utiliza para fermentar y producir proteínas. drogas. En comparación con la medicina tradicional, tiene las siguientes ventajas: (1) El uso de células vivas como sistema de expresión tiene una alta eficiencia de expresión y puede producir medicamentos en grandes cantidades sin la necesidad de grandes equipos ni grandes fábricas. (2) Puede resolver el problema de las fuentes insuficientes de materias primas farmacéuticas tradicionales. Por ejemplo, la insulina es un fármaco que se utiliza para tratar la diabetes. La insulina que un diabético necesita cada año sólo puede extraerse del páncreas de 40 vacas o 50 cerdos. En 1978, los científicos obtuvieron 100 g de insulina a partir de 2.000 litros de caldo de fermentación de E. coli, lo que equivalía a la cantidad extraída de 1.000 kg de páncreas de cerdo. Otro ejemplo, la hormona del crecimiento es un fármaco para tratar el enanismo. Para tratar a un paciente con enanismo, es necesario extraer la hormona del crecimiento de la glándula pituitaria de 80 cadáveres cada año. El uso de bacterias genéticamente modificadas para la producción de fermentación no requiere la obtención de materias primas de animales o humanos. (3) Reducir los costos de producción y reducir el personal de producción y el personal de gestión.

1.4 El auge de los proyectos de proteínas

1. ¿Cuál es la diferencia entre la idea básica de los procedimientos operativos de ingeniería de proteínas y la ingeniería genética?

Respuesta: La ingeniería genética sigue el principio central, produciendo funciones a partir del plegamiento del ADN→ARNm→proteínas, básicamente produciendo proteínas que ya existen en la naturaleza. El plan de proteínas procede de la siguiente manera: determinar la función de la proteína → la estructura de orden superior que debe tener la proteína → el estado plegado que debe tener la proteína → la secuencia de aminoácidos que debe tener → la disposición de bases que debe tener, por lo tanto creando proteínas que no existen en la naturaleza.

2. ¿Entiendes la ingeniería enzimática? La mayoría de las enzimas provienen de proteínas. ¿Cuál es la diferencia entre ingeniería enzimática e ingeniería de proteínas?

Consejos: La ingeniería enzimática se refiere a una ciencia y tecnología que aplica la función biocatalítica de las enzimas a la producción, la vida, el diagnóstico médico y la protección ambiental a través de medios de ingeniería. En términos generales, la ingeniería enzimática incluye dos aspectos: la producción y aplicación de preparados enzimáticos. La aplicación de la ingeniería enzimática se concentra principalmente en la industria alimentaria, la industria ligera y la industria farmacéutica. La alfa-amilasa, la glucoamilasa y la glucosa isomerasa pueden actuar continuamente sobre el almidón para producir jarabe con alto contenido de fructosa en lugar de sacarosa. Las proteasas se utilizan en las industrias de detergentes y pegamentos depilatorios para cuero; las enzimas inmovilizadas también pueden tratar ciertas fallas funcionales causadas por deficiencias congénitas de enzimas o defectos orgánicos. En cuanto al detergente en polvo con enzimas añadidas y al ablandador de carne que vemos en nuestra vida diaria, son la manifestación más directa de la ingeniería enzimática. La llamada ingeniería enzimática consiste en utilizar bacterias de ingeniería para producir preparaciones de enzimas. No existe ningún paso para diseñar la estructura molecular de la enzima en función de su función y luego determinar la secuencia de bases del gen correspondiente en función de la estructura molecular de la misma. enzima. Por lo tanto, el objetivo de la ingeniería enzimática es aprovechar al máximo de forma racional las enzimas existentes, mientras que el objetivo de la ingeniería de proteínas es transformar las moléculas de proteínas existentes. Por supuesto, con el desarrollo de la ingeniería de proteínas, sus resultados también se aplicarán a la ingeniería de enzimas, haciendo que la ingeniería de enzimas forme parte de la ingeniería de proteínas.

3. ¿La transformación de las proteínas naturales debería lograrse manipulando directamente las moléculas de proteínas o manipulando los genes?

No hay duda de que la conversión de proteínas naturales debe conseguirse mediante la manipulación de genes. Las razones principales son las siguientes: (1) Cualquier proteína natural está codificada por genes, lo que significa que la proteína se ha transformado y la proteína transformada puede transmitirse. Si la proteína se transforma directamente, incluso si la transformación tiene éxito, la molécula de proteína transformada no se puede heredar. (2) Modificar genes es más fácil y menos difícil que modificar directamente proteínas.

4. ¿Biorreactor de glándula mamaria animal?

En 65438-0987, el científico estadounidense Gordon y otros produjeron por primera vez una proteína médica, TPA (activador del plasminógeno tisular) en leche de ratón, demostrando que a partir de glándulas mamarias de animales se pueden producir productos de alto valor añadido. . El uso de glándulas mamarias animales para producir productos de alto valor se denomina reactores de glándulas mamarias animales.

¿Por qué utilizar glándulas mamarias de animales como reactores para producir productos proteicos de alto valor? Esto se debe a que la glándula mamaria de los animales es una glándula especializada altamente diferenciada con una capacidad muy fuerte para sintetizar proteínas, especialmente para algunas especies de animales lecheros que han sido modificados genéticamente durante mucho tiempo y están especializados en producir leche. La capacidad de sintetizar proteínas es aún más sorprendente. Una vaca de alta calidad puede producir 10.000 kilogramos de leche al año. Incluso una cabra lechera puede producir 2.000 kilogramos de leche al año. El biorreactor de glándula mamaria animal tiene cuatro ventajas principales: ① alto rendimiento, fácil de recolectar el producto objetivo y puede excretarse del cuerpo del animal con secreción de leche ② el producto objetivo es de buena calidad; El tejido de la glándula mamaria animal no sólo tiene la capacidad de sintetizar proteínas de acuerdo con el flujo de información genética, sino que también tiene un conjunto completo de capacidades para modificar y procesar proteínas, como la glicosilación, la carboxilación, la fosforilación y el ensamblaje molecular. , mientras que ni los microorganismos ni los sistemas vegetales tienen capacidades de posprocesamiento de proteínas tan completas; ③ el costo del producto es bajo; ④ extraer productos de las vacas es relativamente simple;