El principio de la fase líquida de alto rendimiento, es mejor ser más detallado

Categoría: Educación/Académico/Examen

Análisis:

La cromatografía líquida de alta resolución se basa en el método de cromatografía clásica y cita la teoría de la cromatografía de gases, técnicamente , la fase móvil se cambia a transporte a alta presión (la presión máxima de transporte puede alcanzar 4,9?107Pa, la columna cromatográfica se llena con cargas de tamaño de partículas pequeñas mediante un método especial, de modo que la eficiencia de la columna es mucho mayor que la de la clásica); cromatografía líquida (el número de placas por metro puede alcanzar decenas de miles o cientos de miles al mismo tiempo, un detector altamente sensible está conectado detrás de la columna para detectar continuamente el efluente);

Características

1. Alta presión: la cromatografía líquida utiliza líquido como fase móvil (llamado líquido portador). El líquido fluye a través de la columna cromatográfica y encuentra una mayor resistencia para pasar rápidamente a través de la columna cromatográfica, se debe aplicar alta presión al líquido portador. Generalmente puede alcanzar 150~350×105Pa.

2. Alta velocidad: El caudal de la fase móvil en la columna es mucho más rápido que el de la cromatografía clásica, generalmente hasta 1~10ml/min. El tiempo de análisis requerido por la cromatografía líquida de alta resolución es mucho menor que el de la cromatografía líquida clásica, generalmente menos de 1 hora.

3. Alta eficiencia: Recientemente se han desarrollado muchas fases estacionarias nuevas que mejoran en gran medida la eficiencia de la separación.

4. Alta sensibilidad: La cromatografía líquida de alto rendimiento ha adoptado ampliamente detectores de alta sensibilidad, mejorando aún más la sensibilidad del análisis. Por ejemplo, la sensibilidad de un detector de fluorescencia puede alcanzar los 10-11 g. Además, el volumen de muestra utilizado es pequeño, normalmente unos pocos microlitros.

5. Amplio rango de aplicaciones: Comparación entre cromatografía de gases y cromatografía líquida de alto rendimiento: aunque la cromatografía de gases tiene las ventajas de una buena capacidad de separación, alta sensibilidad, velocidad de análisis rápida y fácil operación, está sujeta a Debido a las limitaciones, las sustancias con puntos de ebullición demasiado altos o sustancias con mala estabilidad térmica son difíciles de analizar mediante cromatografía de gases. La cromatografía líquida de alto rendimiento solo requiere que la muestra se pueda convertir en una solución y no requiere vaporización, por lo que no está limitada por la volatilidad de la muestra. En principio, la cromatografía líquida de alta resolución se puede utilizar para separar y analizar sustancias orgánicas con puntos de ebullición altos, estabilidad térmica deficiente y pesos moleculares relativos grandes (más de 400) (estas sustancias representan casi del 75% al ​​80% del total). número de sustancias orgánicas). Según las estadísticas, entre los compuestos conocidos, aproximadamente el 20% se puede analizar mediante cromatografía de gases y aproximadamente entre el 70 y el 80% se puede analizar mediante cromatografía líquida.

La cromatografía líquida de alta resolución se puede dividir en cromatografía en gel de alta resolución, cromatografía líquida de alta resolución hidrófoba, cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa, cromatografía líquida de intercambio iónico de alta resolución y cromatografía líquida de afinidad de alta resolución según las propiedades de su cromatografía en fase estacionaria y cromatografía líquida focalizada de alta resolución. Los principios de separación o análisis de varios compuestos utilizando diferentes tipos de cromatografía líquida de alta resolución son básicamente similares a los de la cromatografía líquida ordinaria correspondiente. La diferencia es que la cromatografía líquida de alta resolución es sensible, rápida, tiene alta resolución y buena repetibilidad y debe realizarse en un cromatógrafo.

Principales tipos de cromatografía líquida de alta resolución y sus principios de separación

Según los diferentes mecanismos de separación, la cromatografía líquida de alta resolución se puede dividir en los siguientes tipos principales:

1. Cromatografía de partición líquido-líquido y cromatografía de fases unidas químicamente

Tanto la fase móvil como la fase estacionaria son líquidas. La fase móvil y la fase estacionaria deben ser inmiscibles entre sí (polaridad diferente para evitar la pérdida de la solución estacionaria) y debe haber una interfaz obvia. Cuando la muestra ingresa a la columna, los solutos se dividen entre las dos fases. Cuando se alcanza el equilibrio, está sujeto a la siguiente fórmula:

En la fórmula, cs—concentración de soluto en fase estacionaria; cm—concentración de soluto en fase móvil; Vs—volumen de fase estacionaria; —volumen de la fase móvil. Existen similitudes entre LLPC y GPC, es decir, el orden de separación depende de K, y los componentes con mayor K tienen mayores valores de retención pero también hay diferencias en la fase de flujo K, mientras que en LLPC la fase de flujo K tiene poco impacto; La fase de flujo K tiene un mayor impacto.

a. Cromatografía de partición líquido-líquido en fase normal (Cromatografía líquida en fase normal): La polaridad de la fase móvil es menor que la polaridad de la solución estacionaria.

b. Cromatografía de partición líquido-líquido en Fase Inversa (Reverse Phase liquid Chromatography): La polaridad de la fase móvil es mayor que la polaridad de la solución estacionaria.

c. Desventajas de la cromatografía de distribución líquido-líquido: aunque los requisitos de polaridad de la fase móvil y la fase estacionaria son completamente diferentes, el líquido estacionario aún se disuelve ligeramente en la fase móvil cuando la fase móvil pasa; La columna cromatográfica, el impacto mecánico provocará la pérdida del fijador. La fase estacionaria unida químicamente desarrollada a finales de la década de 1970 (ver más abajo) puede superar las deficiencias anteriores. Actualmente se utiliza ampliamente (70~80%).

2. Cromatografía líquido-sólido

La fase móvil es líquida y la fase estacionaria es adsorbente (como gel de sílice, alúmina, etc.). Esto se basa en los diferentes efectos de adsorción de las sustancias. Su mecanismo de acción es: cuando la muestra ingresa a la columna cromatográfica, las moléculas de soluto (X) y las moléculas de solvente (S) compiten por la adsorción en los centros activos de la superficie del adsorbente (cuando no se inyecta ninguna muestra, todos los centros activos del adsorbente adsorb S), se puede expresar de la siguiente manera:

Xm + nSa ====== Xa + nSm

En la fórmula: Moléculas de disolvente Xa - moléculas de soluto en; la fase estacionaria; Sm - moléculas de disolvente en la fase móvil.

Cuando la reacción de competencia de adsorción alcanza el equilibrio:

K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]

Donde: K es la adsorción constante de equilibrio. [Discusión: Cuanto mayor es K, mayor es el valor retenido. ]

3. Cromatografía de intercambio iónico

IEC utiliza un intercambiador de iones como fase estacionaria. IEC se basa en el intercambio reversible de iones ionizables de la resina de intercambio iónico con iones solutos de la misma carga en la fase móvil, y estos iones se separan en función de sus diferentes afinidades con el intercambiador.

Tomando como ejemplo el intercambiador aniónico, el proceso de intercambio se puede expresar de la siguiente manera:

X-(en disolvente) + (resina-R4N+Cl-)=== (resina -R4N+ X-) + Cl- (en disolvente)

Cuando el intercambio alcanza el equilibrio:

KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl -] [ X-]

El coeficiente de distribución es:

DX=[-R4N+ /p>

[Discusión: La relación entre DX y el valor de retención]

Cualquier sustancia que pueda ionizarse en un disolvente generalmente puede separarse mediante cromatografía de intercambio iónico.

4. Cromatografía de pares iónicos (Ion Pair Chromatography)

La cromatografía de pares iónicos consiste en añadir uno (o más) iones con cargas opuestas a las moléculas de soluto (llamados contraiones o contraiones) a la fase móvil o en la estacionaria. fase, se combina con iones soluto para formar compuestos de pares iónicos hidrófobos, controlando así el comportamiento de retención de los iones soluto. El principio se puede expresar mediante la siguiente fórmula:

X+fase acuosa + Y-fase acuosa === Iones orgánicos separados (también pueden ser cationes Y-fase acuosa: pares de iones con carga opuesta); se forma la fase móvil (tal como hidróxido de tetrabutilamonio, hidróxido de cetiltrimetilamonio, etc.);

Cuando se alcanza el equilibrio:

KXY = [X+Y-]fase orgánica/[X+]fase acuosa [Y-]fase acuosa

Por definición , el coeficiente de partición es:

DX= [X+Y-]fase orgánica/[X+]fase acuosa = KXY [Y-]fase acuosa

[Discusión: DX y retención relación de valor]

La cromatografía de pares iónicos (especialmente la fase inversa) ha resuelto el problema de separación de mezclas que eran difíciles de separar en el pasado, como ácidos, bases y mezclas iónicas y no iónicas, especialmente algunas bioquímicas. muestras como Separación de ácidos nucleicos, nucleósidos, alcaloides y fármacos.

5. Cromatografía iónica

Utilice resina de intercambio iónico como fase estacionaria y solución electrolítica como fase móvil. El detector de conductividad se utiliza como detector universal Para eliminar la interferencia de fuertes iones electrolíticos de fondo en la fase móvil en el detector de conductividad, se instala una columna de supresión. El principio de reacción de los componentes de la muestra en la columna de separación y la columna de supresión es el mismo que el de la cromatografía de intercambio iónico.

Tome la resina de intercambio aniónico (R-OH) como fase estacionaria y separe los aniones (como el Br-) como ejemplo. Cuando el anión Br- a medir ingresa a la columna cromatográfica con la fase móvil (NaOH), se produce la siguiente reacción de intercambio (la reacción de elución es el proceso inverso a la reacción de intercambio):

Inhibe la reacción en la columna:

R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2O

R-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+ Br-

Se puede ver que el eluyente se convierte en agua con un valor de conductividad muy pequeño a través de la columna de supresión, eliminando la influencia de la conductividad de fondo. El anión de muestra Br- se convierte en el ácido correspondiente; H+Br-, y la conductividad se puede utilizar como método de detección sensible.

La cromatografía iónica es el mejor método para el análisis de aniones en solución. También se puede utilizar para análisis de cationes.

6. Cromatografía de exclusión estérica

La cromatografía de exclusión estérica utiliza gel como fase estacionaria. Funciona de manera similar a un tamiz molecular, pero el tamaño de los poros del gel es mucho mayor que el del tamiz molecular, y generalmente oscila entre varios nanómetros y cientos de nanómetros. Los solutos se separan entre dos fases no por diferencias en sus fuerzas de interacción, sino por el tamaño molecular. La separación está relacionada únicamente con la distribución del tamaño de los poros del gel y el volumen hidrodinámico o tamaño molecular del soluto. Después de que la muestra ingresa a la columna cromatográfica, fluye a través de los espacios y orificios externos del gel con la fase móvil. Algunas moléculas que son demasiado grandes en la muestra no pueden entrar en los poros del gel y quedan excluidas, por lo que pasan directamente a través de la columna y aparecen por primera vez en el cromatograma. Algunas moléculas muy pequeñas pueden entrar en todos los poros del gel y penetrar en estos componentes. El valor de retención en la columna es el mayor y aparece al final del cromatograma.

La cromatografía líquida de alta resolución incluye principalmente un sistema de muestreo y un sistema de infusión. A continuación se describirán el sistema de separación, el sistema de detección y el sistema de procesamiento de datos, sus respectivas composiciones y características.

1. Sistema de muestreo

Generalmente, se utiliza un inyector de inyección de diafragma o una sala de inyección de alta presión para completar la operación de inyección, y el volumen de inyección es constante. Esto es beneficioso para mejorar la reproducibilidad de las muestras analizadas.

2. Sistema de infusión

El sistema consta de tres partes: una bomba de alta presión, un depósito de fase móvil y un medidor de gradiente. La presión general de una bomba de alta presión es l. 47～4.4X107Pa, el caudal es ajustable y estable. Cuando la fase móvil de alta presión pasa a través de la columna de cromatografía, puede reducir el efecto de difusión de la muestra en la columna y acelerar su movimiento en la columna, lo cual es útil. para mejorar la resolución y recuperar muestras, mantener la actividad biológica de la muestra, etc. son todos beneficiosos. El almacenamiento de fase móvil y la instrumentación de gradiente pueden hacer que la fase móvil cambie con las propiedades de la fase estacionaria y la muestra, incluido el cambio de polaridad, la fuerza iónica, el valor de pH del eluyente o el uso de inhibidores o desnaturalizantes competitivos. Esto permite una separación eficaz de varias sustancias (incluso si se diferencian solo en un grupo o son isómeros).

3. Sistema de separación

Este sistema incluye columnas cromatográficas, tubos de conexión y termostatos. Las columnas cromatográficas suelen tener entre 10 y 50 cm de longitud (cuando se necesitan dos, se puede añadir un tubo conector entre las dos), con un diámetro interior de 2 a 5 mm y están hechas de acero inoxidable de alta calidad o tubos de vidrio de paredes gruesas. o aleaciones de titanio contiene una fase estacionaria con un tamaño de partícula de 5 a 10 μm (compuesta por una matriz y un líquido estacionario). La matriz en la fase estacionaria está compuesta de resina o gel de sílice con alta resistencia mecánica, los cuales. son inertes (como se elimina el gen básico del ácido silícico en la superficie del gel de sílice), porosidad (diámetro de poro de hasta 1000?) y gran área de superficie específica, junto con el hecho de que su superficie está recubierta mecánicamente (como en). la preparación de fases estacionarias en cromatografía de gases) o acoplados químicamente a diversos genes (por ejemplo, grupo fosfato, grupo amonio cuaternario, grupo hidroximetilo, grupo fenilo, grupo amino o grupo alquilo de varias longitudes de cadenas de carbono, etc.) o ligandos. este tipo de fase fija tiene buena selectividad para sustancias con diferentes estructuras. Por ejemplo, después de conjugar la aglutinina de guisante (PSA) en la superficie del gel de sílice poroso, se puede aislar una glicoproteína en los fibroblastos.

Además, las partículas de la matriz de la fase estacionaria son pequeñas y el lecho de la columna puede alcanzar fácilmente un estado uniforme y denso, lo que puede reducir fácilmente el efecto de difusión de las corrientes parásitas. El tamaño de las partículas de la matriz es pequeño, los microporos son poco profundos y la transferencia de masa de la muestra en el área de los microporos es corta. Estos son beneficiosos para reducir el ancho de la banda espectral y mejorar la resolución. Según el análisis teórico de la eficiencia de la columna, cuanto menor es el tamaño de partícula de la matriz, mayor es el número teórico N de platos. Esto demuestra además que un tamaño de partícula de matriz pequeño mejorará la resolución.

Además, el termostato de cromatografía líquida de alta resolución puede ajustar la temperatura desde temperatura ambiente hasta 60 °C. Al mejorar la velocidad de transferencia de masa y acortar el tiempo de análisis, se puede aumentar la eficiencia de la columna de cromatografía.

4. Sistema de detección

Hay tres detectores comúnmente utilizados en cromatografía líquida de alta resolución: detectores ultravioleta, detectores de índice de refracción diferencial y detectores de fluorescencia.

(1) Detector ultravioleta

Este detector es adecuado para detectar muestras con propiedades de absorción de luz ultravioleta (o luz visible). Sus características: se pueden utilizar una amplia gama de usos (como proteínas, ácidos nucleicos, aminoácidos, nucleótidos, péptidos, hormonas, etc.) (el límite de detección inferior no es amplio y no lineal); sensible a los cambios de temperatura y caudal. Sensible; puede detectar muestras eluidas con soluciones de gradiente.

(2) Detector de índice de refracción diferencial

Cualquier componente de la muestra con un índice de refracción diferente al de la fase móvil se puede detectar utilizando un detector de índice de refracción diferencial. En la actualidad, este sistema de detección se utiliza principalmente para la detección de compuestos de azúcar. Este sistema es muy versátil y fácil de operar, pero tiene baja sensibilidad (el límite de detección inferior es 10-7 g/ml. Los cambios en la fase móvil provocarán cambios en el índice de refracción). Por lo tanto, no es adecuado para análisis de trazas ni para análisis. para la detección de muestras de elución en gradiente.

(3) Detector de fluorescencia

Para cualquier sustancia fluorescente, bajo ciertas condiciones, la intensidad de fluorescencia de su luz emitida es proporcional a la concentración de la sustancia. Por tanto, este detector sólo es adecuado para la determinación de compuestos orgánicos fluorescentes (como hidrocarburos aromáticos policíclicos, aminoácidos, aminas, vitaminas y determinadas proteínas, etc.), y su sensibilidad es muy alta (el límite inferior de detección es 10-12 ~ 10-14 g/ml), se puede utilizar para análisis de trazas y detección de trabajos de elución en gradiente.

(5) Sistema de procesamiento de datos

Este sistema puede recopilar, almacenar, mostrar, imprimir y procesar datos de prueba, de modo que la separación, preparación o identificación de muestras se pueda realizar correctamente. . realizar.