Usos de la cromatografía líquida de alta resolución
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es actualmente uno de los métodos eficaces más utilizados para separar, analizar y purificar compuestos orgánicos (incluidas sustancias inorgánicas que pueden convertirse en compuestos orgánicos mediante reacciones químicas). Entre los compuestos orgánicos conocidos, alrededor del 80% se puede separar y analizar mediante cromatografía líquida de alta resolución. Dado que este método tiene condiciones suaves y no destruye la muestra, es especialmente adecuado para compuestos orgánicos con altos puntos de ebullición, dificultad de gasificación y volatilización. , y mala estabilidad térmica y materia viva.
Los sistemas HPLC generalmente constan de bombas de infusión, inyectores, columnas cromatográficas, detectores, dispositivos de registro y procesamiento de datos, etc. Entre ellos, la bomba de infusión, la columna cromatográfica y el detector son las partes clave. Algunos instrumentos también tienen dispositivos de elución en gradiente, desgasificador en línea, inyector automático, columna o protección, controlador de temperatura de columna, etc. Los instrumentos HPLC modernos también tienen sistemas de control por microcomputadora para el control automatizado de instrumentos y el procesamiento de datos. Los instrumentos de HPLC preparativa también están equipados con dispositivos automáticos de recolección de fracciones.
En la actualidad, los fabricantes de instrumentos de HPLC comunes en el extranjero incluyen Waters Company, Agilent Company (anteriormente HP Company), Shimadzu Company, etc., y a nivel nacional están Shanghai Wufeng Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai Hegong Scientific. Instrument Co., Ltd., Dalian Yilite Company, Beijing Innovation Tongheng, Beijing Wenfen, etc.
1. Bomba de infusión
1. Estructura y rendimiento de la bomba
La bomba de infusión es uno de los componentes más importantes del sistema HPLC. El rendimiento de la bomba afecta directamente la calidad general y la confiabilidad de los resultados del análisis. La bomba de infusión debe tener el siguiente rendimiento: ① El caudal es estable y su RSD debe ser inferior al 0,5%, lo que está relacionado con la precisión del análisis cualitativo y cuantitativo. ② El rango de caudal es amplio y el tipo analítico; debe ajustarse continuamente dentro del rango de 0,1 a 10 ml/min, y el tipo de preparación debe poder alcanzar 100 ml/min. ③ La presión de salida es alta, generalmente debe poder alcanzar 150 ~ 300 KG/CM2: ④ El líquido el volumen del cilindro es pequeño; ⑤ Buen rendimiento de sellado y resistencia a la corrosión.
Existen muchos tipos de bombas, que se pueden dividir en bombas de presión constante y bombas de flujo constante según la naturaleza de la infusión. Las bombas de flujo constante se pueden dividir en bombas de jeringa en espiral, bombas alternativas de émbolo y bombas alternativas de intervalo según sus estructuras. La bomba de presión constante se ve afectada por la sombra de la columna y el caudal es inestable; el cilindro de la bomba de tornillo es demasiado grande y estas dos bombas se han eliminado, actualmente la más utilizada es la bomba alternativa de émbolo.
El volumen del cilindro de líquido de la bomba alternativa de émbolo es pequeño, de hasta 0,1 ml, por lo que es fácil de limpiar y reemplazar la fase móvil. Es especialmente adecuado para recirculación y elución en gradiente. puede ajustar fácilmente el caudal. No se ve afectado por la presión de la columna; la presión de la bomba puede alcanzar los 400 KG/CM2. La principal desventaja de ADW es que el pulso de salida es relativamente grande, lo que ahora se supera mediante el uso de un sistema de bomba dual. Las bombas dobles se pueden dividir en tipo paralelo y tipo serie según el modo de conexión. En general, la reproducibilidad del flujo de las bombas paralelas es mejor (RSD es aproximadamente 0,1% y la de las bombas en serie es 0,2~0,3%), pero hay algunas. más posibilidades de falla (debido a que hay más válvulas de retención), el precio también es más caro.
2. Inyector
Generalmente, las válvulas de inyección de seis vías se utilizan comúnmente para el análisis HPLC (los modelos 7725 y 7725I de la empresa estadounidense RHEODYNE son los componentes clave). Juntas de estanqueidad circulares (Rotor) y base fija (Estator). Es resistente a alta presión (35~40MPA), tiene un volumen de inyección preciso, buena repetibilidad (0,5%) y es fácil de operar. Los métodos de inyección con válvula de seis vías incluyen el método de llenado parcial de líquido y el método de llenado completo de líquido. ① Cuando se utiliza el método de llenado parcial para inyectar muestras, el volumen de inyección no debe ser superior al 50 % (máximo 75 %) del volumen del bucle cuantitativo, y el volumen de inyección debe ser preciso y el mismo cada vez. La precisión y repetibilidad de este método de inyección dependen de la competencia del inyector en el muestreo, y es fácil que se produzca un ensanchamiento del pico causado por la inyección. ② Cuando se utiliza el método de llenado completo para la inyección de muestra, el volumen de inyección no debe ser inferior a 5 a 10 veces 9 y al menos 3 veces el volumen del bucle cuantitativo. Esto puede reemplazar completamente el bucle cuantitativo y la fase móvil, eliminando el. Efecto de la pared del tubo y garantiza la precisión del grado de inyección y la repetibilidad.
3. Columna Cromatográfica
La cromatografía es un método de separación y análisis, y la separación es el núcleo. Por lo tanto, la columna cromatográfica responsable de la separación es el corazón del sistema de cromatografía. Los requisitos para las columnas cromatográficas son una alta eficiencia de la columna, buena selectividad y una rápida velocidad de análisis.
Varios rellenos de partículas disponibles comercialmente para HPLC incluyen gel de sílice poroso y fase unida a base de gel de sílice, alúmina, microesferas de polímero orgánico (incluida la resina de intercambio iónico), carbono poroso, etc. El tamaño de partícula es generalmente 3,5, 7, 10 UM, etc. ., la eficiencia teórica de la columna puede alcanzar entre 50.000 y 160.000/metro. Para el análisis general, sólo se necesita una eficiencia de columna de 5.000 placas; para el análisis de homólogos, sólo 500 son suficientes; para una separación más difícil de pares de sustancias, se puede utilizar una columna de hasta 20.000, por lo que generalmente una longitud de columna de aproximadamente 10 a 20.000 placas. 30 CM es suficiente. Puede satisfacer las necesidades de análisis de mezclas complejas.
La eficiencia de la columna se ve afectada por factores dentro y fuera de la columna. Para lograr la mejor eficiencia de la columna cromatográfica, además del pequeño volumen muerto fuera de la columna, no debe haber una estructura de columna razonable. (reducir el volumen muerto fuera del lecho empacado tanto como sea posible) y tecnología de llenado. Incluso con la mejor tecnología de llenado, las condiciones de llenado en el centro de la columna y a lo largo de la pared del tubo son siempre diferentes. Las partes cercanas a la pared del tubo están más sueltas, son propensas a canalizarse y el caudal es más rápido, lo que afecta al colector. del agente de lavado, lo que provoca que la banda se ensanche, que es el efecto de pared del tubo. Esta área de la pared de la tubería es aproximadamente 30 veces el espesor del diámetro del material desde la pared de la tubería hacia adentro. En un sistema de cromatografía líquida general, el impacto de los efectos extracolumna sobre la eficiencia de la columna es mucho mayor que el efecto de la pared del tubo.
4. Detector
Los detectores HPLC se dividen en dos categorías: detectores generales y detectores especiales.
1. Los detectores universales pueden medir continuamente todos los cambios característicos del efluente de la columna cromatográfica, generalmente utilizando métodos de medición diferencial. Dichos detectores incluyen detectores de índice de refracción diferencial, detectores de constante dieléctrica, detectores de conductividad, etc. Los detectores universales tienen una amplia gama de aplicaciones. debido a que responde a la fase móvil, se ve fácilmente afectado por cambios de temperatura, fase móvil y componentes. El ruido y la deriva son relativamente grandes, la sensibilidad es baja y no se puede utilizar la elución en gradiente.
2. Se utilizan detectores especializados para medir cambios en ciertas características de componentes de muestras separados. Este tipo de detector es sensible a ciertas propiedades físicas o químicas de los componentes de la muestra que la fase móvil no posee, o al menos no muestra en condiciones de operación. Dichos detectores incluyen detectores de UV, detectores de fluorescencia, detectores radiactivos, etc.