PCR de bibliotecas de ADNc
Aplicación de la PCR
Clonación directa de genes diana
En comparación con los métodos tradicionales de clonación de genes, la PCR tiene las ventajas de ser rápida y sencilla, pero el propósito de la clonación El uso de PCR es una limitación de los genes es que se debe conocer la secuencia de nucleótidos que flanquea la secuencia de interés para preparar los cebadores. Por lo tanto, este enfoque tiene importantes limitaciones.
Los productos de PCR con extremos planos se pueden usar para la clonación directamente, pero al introducir diferentes sitios de restricción en ambos lados del gen objetivo a clonar y combinarlos con cebadores apropiados, se pueden seleccionar y clonar. El gen diana amplificado se clona en el vector para evitar la circularización del propio vector y mejorar la eficiencia de la clonación.
Clonación de ADNc
Utilizando la tecnología PCR, se puede construir una biblioteca de ADNc a partir de una pequeña cantidad de ARNm añadiendo solo un paso de reacción de transcripción inversa. Utilizando ARNm como plantilla y oligo(dT) como cebador, la primera hebra de ADNc se sintetiza in vitro bajo la catálisis de la ADN polimerasa dependiente de ARN y luego se amplifica mediante PCR.
Si se añade un homodímero de residuos de ácido guanílico al extremo 3' de la cadena, se pueden utilizar oligo(dT) y oligo(dC) como cebadores para la posterior amplificación por PCR, y en su caso, sitios de restricción. se pueden agregar a los extremos 5' de estos cebadores para facilitar la clonación del ADN bicatenario resultante en un vector apropiado.
En algunos casos, si la secuencia de nucleótidos al final del ARN (o su gen), la secuencia de nucleótidos en el extremo 5' del ARNm o la secuencia de aminoácidos en el extremo N de la proteína codifica si se sabe, se puede diseñar. Se utilizan cebadores dobles específicos para clonar directamente ADNc específico de un gen de interés específico, eliminando así operaciones que requieren mucho tiempo, como la detección de clones de ADNc en una biblioteca de ADNc.