¿Tiene la ADN polimerasa II actividad transcriptasa inversa?
Número de clics: 1975 Tiempo de publicación: 2022-4-28 Fuente: Este sitio es solo para referencia La reimpresión está prohibida; de lo contrario, usted será responsable de su propia responsabilidad. /p>
La enzima es un tipo de biocatalizador extremadamente importante, con las características de alta eficiencia catalítica y fuerte especificidad de reacción. La mayoría de las reacciones bioquímicas requieren la participación de enzimas y la detección de ácidos nucleicos no es una excepción. Diferentes tipos de enzimas moleculares desempeñan funciones importantes en diferentes etapas experimentales de la detección de ácidos nucleicos.
I.Transcriptasa inversa, comparte las características y aplicaciones de las enzimas
La transcripción inversa es el proceso de síntesis de ADN utilizando ARN como plantilla, es decir, síntesis de ADN guiada por ARN. En este proceso, la síntesis y transcripción de ácidos nucleicos (ADN a ARN) es en dirección opuesta al flujo de información genética (ARN a ADN), por lo que se denomina transcripción inversa. El proceso de transcripción inversa está catalizado por la transcriptasa inversa.
La mayoría de las enzimas transcriptasa inversa tienen varias actividades.
①Actividad de la ADN polimerasa;
Utilizando ARN como plantilla, cataliza el proceso de polimerización de dNTPs en ADN. La capacidad sintética de la transcriptasa inversa determina la longitud de la cadena de ADNc producida; algunas transcriptasas inversas de MMLV modificadas genéticamente pueden unir hasta 1.500 nucleótidos en un único sitio de unión, y su capacidad de unión es aproximadamente 65 veces mayor que la de la transcriptasa inversa de MMLV de tipo salvaje.
La transcriptasa inversa no tiene actividad exonucleasa 3' → 5', por lo que no tiene función de corrección. Por lo tanto, la tasa de error del ADN sintetizado por la transcriptasa inversa es relativamente alta según MMLV. Hay un nucleótido incorrecto por cada 15.000 a 27.000 nucleótidos sintetizados.
(2) Actividad de la ARNasa H;
La molécula híbrida formada por la síntesis de ADNc y ARN molde catalizada por la transcriptasa inversa se hidrolizará desde el extremo 5' de la molécula de ARN mediante RNasa H, pero la presencia de actividad de RNasa H puede reducir la eficiencia de la transcripción inversa, por lo que las transcriptasas inversas diseñadas generalmente reducen o incluso eliminan la actividad de RNasa H para mejorar la eficiencia de la síntesis de ADNc.
3) Actividad de la ADN polimerasa dirigida por ADN;
La primera cadena sencilla de ADN sintetizada mediante transcripción inversa se utiliza como plantilla y el dNTP se utiliza como sustrato para sintetizar el segundo ADN. molécula.
Además, la transcriptasa inversa diseñada es termotolerante, lo que ayuda a desnaturalizar el ARN con una estructura secundaria fuerte y/o un alto contenido de GC, lo que permite a la transcriptasa inversa leer obtener secuencias para aumentar la duración de la síntesis de ADNc y mejorar la eficiencia de la síntesis.
La transcriptasa inversa GenFQ III es una transcriptasa inversa de próxima generación diseñada genéticamente que ha mejorado enormemente la estabilidad térmica y no tiene actividad de ARNasa H. Puede sintetizar ADNc de primera cadena a 42-55 °C (la temperatura alta es beneficiosa para abrir la estructura secundaria del ARN) y la temperatura de reacción óptima es 50 °C. Tiene las características de alta sensibilidad, alta especificidad, alta capacidad de polimerización, alta estabilidad térmica y larga vida media. La enzima tiene una mayor afinidad por los moldes y es adecuada para la transcripción inversa de pequeñas cantidades de moldes y genes de baja copia.
La eficiencia de síntesis es 95,1, lo que muestra una alta eficiencia de síntesis de ADNc y una buena linealidad de dilución en gradiente de ARN.
Fuerte estabilidad térmica, la estabilidad térmica durante 7 días no tiene ningún efecto sobre la eficiencia de la transcripción inversa
II.Taq ADN polimerasa
La tecnología PCR ha cambiado la biología molecular moderna. mientras que la ADN polimerasa Taq cambia la PCR. La ADN polimerasa Taq es una ADN polimerasa resistente al calor aislada de la bacteria acuática Thermus. Se utiliza principalmente en los campos de la PCR directa, la detección de alelos, la secuenciación de Sanger y la clonación de TA.
La ADN polimerasa Taq es una ADN polimerasa termoestable con una temperatura catalítica óptima de 75-80°C y puede mantener una actividad superior a 50 después de media hora a 95°C. La ADN polimerasa Taq es una de las pocas ADN polimerasas con actividad exonucleasa 5'-3'. Escinde sondas de ADN radiomarcadas en el extremo 5', lo que permite la detección específica de productos de PCR a través de cambios en la señal radiactiva.
Sin embargo, la tasa de síntesis de ácido nucleico de la ADN polimerasa Taq ordinaria a 22°C sigue siendo muy baja, alrededor de 0,25 nucleótidos/segundo/molécula de enzima, lo que significa que los cebadores no se han emparejado bien y la enzima no se ha emparejado bien. La síntesis ha sido catalizada, dando como resultado una amplificación no específica.
La ADN polimerasa Taq de inicio en caliente, desarrollada sobre la base de la ADN polimerasa Taq, utiliza modificadores enzimáticos para inhibir la actividad de la ADN polimerasa a temperatura ambiente. Cuando se calienta a la temperatura de desnaturalización, los modificadores se vuelven inactivos. Se libera actividad enzimática, lo que permite que la reacción de PCR se desarrolle normalmente, resolviendo el problema de la amplificación no específica causada por dímeros de cebadores o desajustes en la reacción de PCR y mejorando la especificidad de la reacción de PCR.
La ADN polimerasa Flash Robust HotStart (A210) de Jifan es una nueva enzima de arranque en caliente que se modifica directamente basándose en la ADN polimerasa Taq de tipo salvaje. Utiliza bloqueo de doble anticuerpo, que puede prevenir eficazmente la amplificación no específica causada por desajustes o dímeros de cebador e inhibir las señales fluorescentes generadas por la degradación de la sonda. Puede prevenir eficazmente la amplificación no específica causada por desajustes o dímeros de cebador, inhibir eficazmente la señal de fluorescencia generada por la degradación de la sonda y tiene una eficiencia de amplificación ultraalta y una alta sensibilidad de amplificación (puede amplificar hasta un número de copias de un solo dígito). especificidad, con fuerte tolerancia a la sangre y a los inhibidores de la PCR. Es adecuado para una variedad de reacciones de PCR y qPCR de inicio en caliente basadas en la ADN polimerasa Taq, y puede usarse para amplificar genes de baja copia a partir de plantillas complejas (genómicas y ADNc), y también puede usarse para amplificación directa por PCR, como como amplificación directa de la sangre.
Utilizando un plásmido sin peste como plantilla, se realizaron nueve diluciones en gradiente de 10 veces. La concentración del número de copias del plásmido en el noveno gradiente de dilución fue de aproximadamente 6 copias/2 μl. La cantidad de plantilla utilizada para cada gradiente de dilución es de 2 l por pocillo. Se puede ver que A210 tiene una linealidad excelente en un amplio rango de cantidad de plantilla y puede detectar fácilmente copias de un solo dígito de la plantilla que se va a probar.
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Fuente: Beijing Jifan Biotechnology Co., Ltd.: Jifan Biotechnology (Beijing) Co., Ltd.
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Etiqueta: transcriptasa inversa Taq ADN polimerasa
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