Semana 3: Identificación de fasiARN a partir de regiones de genes codificantes mediante perfiles de ARN pequeño de soja.
Invasión y eliminación
El microARN es un inhibidor multifuncional ubicuo, que incluye (1) microARN (miARN), que es procesado por el tallo-bucle formado por el ARNm. (2) ARN de interferencia pequeño (ARNip), generalmente derivado del proceso de ARN polimerasa dependiente de ARN en las plantas. Construimos y analizamos un mapa de expresión de ARN pequeños de soja e identificamos más de 500 ARNip fásicos (phasiRNA; derivados de loci PHAS), 483 de los cuales se superponían con genes codificadores de proteínas anotados. Al integrar datos de miARN y extremos de ARN (PARE), se detectaron 20 objetivos de miARN en 127 sitios PHAS. La categoría principal de loci PHAS (208, que representan 41) corresponde al gen NB-LRR. Algunos de estos pequeños ARN se acumulan preferentemente en nódulos. En el sitio PHAS, también se observaron representaciones novedosas y patrones de fase no clásicos de TAS3. Se predice que el locus PHAS no codificante desencadenado por miR4392 se acumula preferentemente en las anteras; se predice que el fasiRNA dirigido a elementos transponibles tendrá una abundancia máxima en el desarrollo reproductivo de la soja. Por tanto, los fasiRNA muestran una gran diversidad entre dicotiledóneas. Identificamos nuevos miARN y evaluamos la precisión de los miARN de soja registrados en miRBase, mejoramos significativamente la anotación de los miARN de soja, facilitamos la mejora de las anotaciones de miRBase e identificamos nuevos miARN y sus objetivos con alta rigurosidad.
Qué hace el artículo:
Los pequeños ARN no codificantes desempeñan funciones importantes en el desarrollo, la diferenciación celular, la adaptación al estrés biótico y abiótico y la estabilidad del genoma. La principal actividad de los ARN pequeños es regular negativamente patrones de expresión genética o ARNm específicos mediante degradación dirigida, represión traduccional o dirigiendo modificaciones de la cromatina. Hasta ahora se han identificado varios tipos diferentes de ARN pequeños. El microARN (miARN) y el pequeño ARN de interferencia (ARNip) son los microARN más estudiados en las plantas. Estos se producen a partir de diferentes precursores y por diferentes vías. Los MIRNA suelen tener una longitud de 21 a 22 nucleótidos y se originan a partir de precursores de ARN largos no codificantes transcritos a partir de genes de MiRNA por la ARN polimerasa II. Los precursores de miARN forman un tallo-bucle que es procesado por DICER-LIKE1 (DCL1) u otras enzimas DCL (muy raramente) para producir un único dúplex de ARN pequeño (miARN/miARN*) con dos nucleótidos sobresalientes en el extremo 3'. Una hebra del pequeño ARN dúplex es el miARN maduro, que se denomina hebra guía. Se unirá a la proteína Argonauta (AGO) para formar un complejo efector (el llamado complejo silenciador inducido por ARN-RISC), que dirige la degradación o represión traduccional del miARN objetivo. La otra hebra del dúplex, el miARN* o hebra pasajera, se degrada rápidamente y normalmente no se acumula. Los ARNip normalmente se originan a partir de precursores de ARN bicatenario largo (ARNds) totalmente complementarios, que normalmente se forman mediante ARN polimerasa dependiente de ARN (RDR) o transcripciones sentido/antisentido recocidas. Se han identificado varios tipos de ARNip en plantas, el principal es el ARNip de heterocromatina, que desempeña un papel clave en el establecimiento y mantenimiento de la metilación de la citosina y las modificaciones represivas de las histonas. Los ARNip también pueden actuar como señales móviles y los efectos silenciadores pueden propagarse de una célula a otra o a distancias mayores mediante el movimiento de los ARNip.
Los científicos han identificado una clase interesante de ARNip que son productos de la escisión progresiva de precursores de ARN bicatenario largos en incrementos de 21 nucleótidos, produciendo ARN pequeños escalonados o completamente espaciados. Estos ARNip, denominados ARNip alineados en fase (ARNip de PHA), se generan mediante escisión de miARN guiada específicamente, siguiendo un patrón de clic simple o doble, correspondiente a un sitio objetivo de miARN de 22nt o dos de 21nt, respectivamente.
El producto de ARNm escindido y sin tapar sirve como sustrato para RDR6, produciendo un precursor de ARNbc, que luego es escindido por DCL4 para producir un ARNip en fase de 21 nucleótidos. Se ha demostrado que algunos ARNip fásicos desempeñan un papel en la transregulación de genes diana, por lo tanto, este ARNip se llamó inicialmente tasiRNA, pero muchos más loci genéticos producen patrones en fase de ARNip de acción trans desconocidos (sitios phas) y, por lo tanto, generalmente se describen como "fasiARN". TasiRNA regula el ARNm escindiendo sitios objetivo complementarios, como muchos miARN de plantas. El tasiRNA más conocido es una colección de factores de respuesta de ARN-auxina de interferencia pequeños trans (tasiARF) producidos por el SIRNA GENE3 de acción trans (TAS3). TasiARF actúa reprimiendo los genes del factor de respuesta a las auxinas (ARF2, ARF3/ETTIN y ARF4). Se han identificado muchos fasiRNA en muchas especies de plantas, incluidas Arabidopsis, arroz y uva. El número de loci PHAS conocidos varía ampliamente entre especies, desde más de 800 en el arroz silvestre común hasta menos de 30 en Arabidopsis thaliana. Entre las leguminosas, se detectaron 114 y 41 loci PHAS en Medicago truncatula y soja, respectivamente.
La soja es el cultivo económico más importante del mundo y una de las principales fuentes de proteínas y aceite comestible. La secuencia del genoma de la soja ya está disponible públicamente. Las secuencias del genoma, junto con los datos generados por tecnologías de secuenciación de próxima generación, permiten identificar y cuantificar ARN pequeños en todo el genoma. Hasta la fecha, se han identificado cientos de miARN en la soja. Sin embargo, muchos miARN recientemente anotados y sus objetivos no están bien validados, e incluso los miARN anotados a menudo se corrigen después de datos experimentales más sólidos. El sitio PHAS es peor que el sitio pequeño del ácido ribonucleico. En comparación con Medicago truncatula, se han identificado muchos menos loci PHAS en la soja. Con datos extensos de ARN pequeños y una mayor profundidad de secuenciación, se pueden descubrir más PHAS. Este estudio analizó una gran cantidad de pequeñas bibliotecas de ARN de diferentes tejidos, construyó un mapa de expresión de ARN pequeño e identificó de manera integral sitios PHAS en la soja. Demostramos que muchos genes codificadores de proteínas en la soja son loci PHAS. Además de NB-LRR, previamente identificado como un locus PHAS en legumbres, identificamos cientos de otros genes codificadores de proteínas que producen fasiRNA. Integramos análisis paralelos de datos de extremos de ARN (PARE) para identificar la activación de miARN de estos loci PHAS. A partir de estos datos, validamos los miARN de soja registrados en miRBase (versión 20) e identificamos nuevos miARN, lo que demuestra que muchos miARN informados anteriormente tienen características de siARN. Basándonos en el análisis de expresión, demostramos la expresión específica de fasiRNA y miRNA conocidos y recientemente descubiertos en diferentes tejidos y bajo diferentes tratamientos.
Resumen
La atención se centra en los diagramas de flujo y las condiciones del filtro.
Explora las diferencias en el enriquecimiento de miARN en diferentes tejidos (o combinaciones de tejidos).
Figura 1. Perfiles de expresión de miARN nuevos y de tejido primero.
(a) Los nuevos miARN identificados en este estudio incluyen muchos que están enriquecidos diferencialmente en tejidos u órganos específicos.
(b) El análisis de los miARN de soja descritos anteriormente también reveló una variedad de sesgos tisulares en flores, hojas y nódulos de raíces.
Figura 2. El gen PHAS codifica una proteína.
El genoma de la soja contiene más loci que codifican proteínas productoras de fasiRNA que otros genomas vegetales estudiados.
(a) Tipo y número de loci que codifican PHAS.
(b)n Perfil de expresión y agrupamiento sistemático de genes PHAS en la familia B-LRR.
(c) Distribución y agrupamiento de genes fasi-NB-LRR en el genoma de la soja.
Figura 3. Mecanismos de activación y procesamiento del TAS3 TasiRNA de soja.
(a) Patrón de enriquecimiento de la suma de tasiRNA de los seis loci TAS3 en el genoma de la soja en tejidos de flores, hojas, nódulos de raíces y semillas. TAS3a y TAS3b son iguales y no se pueden medir por separado.
(b) TasiARF de tas3a/b/c/d/e/f. Todos los ARNip TAS3 598D () y tas 3 597d () pertenecen a la familia del factor de respuesta a auxina (ARF), de acuerdo con sus secuencias relativamente conservadas (datos no mostrados).
(c) El locus TAS3 de la soja tiene dos o tres sitios objetivo de miR390, y la dirección de fase relativa a estos sitios objetivo indica la atipicidad del ARNip desencadenado por el miARN de 21 nt en el procesamiento de TA3E y TA3F. dirección.
Figura 4. Sitio ARF3 PHAS activado por TasiARF.
(a) tasiARF de soja TAS3 apunta a ARF3 en dos sitios idénticos, y el sitio de escisión 59 (abajo) y el sitio 39 donde no se observa escisión se confirman mediante PARE. Esta actividad tasiARF de doble clic genera un ARNip en fases (imagen del medio). El eje y es la "puntuación" de la fase, que es el valor p estimado de la significancia de la fase (ver Métodos). Las dos imágenes a continuación son nuestros navegadores web y muestran datos de ARN pequeño (en el medio) o PARE (abajo), con la línea discontinua naranja que indica el sitio de escisión de tasiARF. Las manchas de colores son ARN pequeños que muestran abundancia en el eje y. Las manchas de color azul claro representan ARNs de 21 nt, el verde representa ARNs de 22 nt, el naranja representa ARNs de 24 nt y otros colores corresponden a otros tamaños de ARNs. El cuadro rojo es el exón anotado (región rosada no traducida). La línea violeta indica la frecuencia k-mer de la región repetida.
(b) Los datos del panel A muestran una cascada de biogénesis de fasiRNA de dos impactos, en la que miR390 de 21 nucleótidos (nt) desencadena la biogénesis de Taxiarf de 21 nt y pasa. Un mecanismo de dos impactos, Taxiarf desencadena la producción de ARNip secundarios adicionales de ARF3 y ARF4 (consulte la Figura complementaria 7 en línea). siRNA ARF puede operar en cis o trans.
Figura 5. PhasiRNA altamente enriquecido en anteras derivadas de loci de deshidrogenasa mutantes.
(a) Vías bioquímicas que implican a la andrógeno deshidrogenasa.
(b) Ilustración del proceso de generación de fasiRNA a partir del locus relacionado con la andrógeno deshidrogenasa. A la izquierda, el segmento del gen que forma la horquilla se procesa en fasiARN.
(c) Lea los niveles de abundancia (columnas rojas) y los niveles de expresión génica (columnas verdes) de desencadenantes de miARN y fasiARN de dos tejidos diferentes, normalizados a RP5M y RP25M.
¿Cómo determinar si coincide con tRNA, rRNA, snRNA y snoRNA?
Secuenciación de gradosma: /custom/LC_Bio/100427/index
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