Mecanismos relacionados con la reprogramación nuclear

Un experimento en el que se trasplantó con éxito el núcleo de una célula viva a un óvulo de rana enucleado demostró por primera vez que el estado de diferenciación de las células se puede revertir experimentalmente. Briggs y King produjeron con éxito renacuajos nadadores por primera vez trasplantando núcleos de blastocistos de Rana pipiens. Sin embargo, descubrieron que si se trasplantaran núcleos de una etapa posterior del desarrollo embrionario (enteroblasto), se produciría un desarrollo anormal. Por tanto, propusieron que la diferenciación celular puede implicar una transformación nuclear irreversible. Poco después, se llevaron a cabo experimentos similares con la rana sudafricana Xenopus laevis. Siguiendo el mismo enfoque experimental, descubrieron que incluso si los núcleos utilizados para el trasplante fueran de células completamente diferenciadas, en este caso células epiteliales del intestino delgado de ranas donantes, podrían obtener ranas macho y hembra completamente normales y fértiles. Estos resultados experimentales muestran que la diferenciación celular se puede revertir por completo y que no son necesarios cambios nucleares irreversibles. Este proceso implica cambios en la expresión genética en el núcleo celular, pero no en los genes propiamente dichos. Por lo tanto, incluso durante el desarrollo, las células pueden convertirse en entidades distintas, funcionales y estables, pero el genoma es el mismo en todos los diferentes tipos de células (excepto en las células inmunitarias que producen anticuerpos). Por tanto, conservan el potencial de formar otros tipos diferentes de células.

El gran avance en este campo provino del experimento realizado con la oveja Dolly, en la que se trasplantaron los núcleos de células mamarias aisladas de ovejas adultas y se cultivaron in vitro en huevos de oveja a los que se les extrajeron los núcleos de cabras adultas normales. La oveja Dolly y los estudios de exploración posteriores demostraron que el proceso de diferenciación celular podría revertirse por completo utilizando los núcleos de mamíferos adultos, y sugirieron que este mecanismo también podría aplicarse a los humanos. El experimento de obtener células madre embrionarias de mono mediante el trasplante de núcleos de células adultas de mono es un paso importante para probar esta hipótesis. Estas células, con funciones completas de crecimiento y diferenciación, se aislaron de blastocistos desarrollados después del trasplante de núcleos de monos adultos en huevos de mono enucleados. Por tanto, es muy probable que los óvulos humanos también contengan factores que puedan revertir el proceso de diferenciación de las células humanas adultas. Uno de los aspectos destacables del uso de óvulos para la reprogramación nuclear es que los óvulos tienen la capacidad de reprogramar los núcleos diferenciados de los espermatozoides con una eficiencia del 100%. Una ventaja adicional es que este enfoque no requiere cambios genéticos permanentes en los núcleos trasplantados y las células reprogramadas que generan (es decir, inserción viral, forzar la activación de genes específicos, etc.). Por tanto, es particularmente importante descubrir el mecanismo. La pregunta que debemos responder es ¿por qué tiene éxito la reprogramación? ¿Y qué factores suelen provocar que este proceso falle, incluso cuando se utilizan óvulos?

Alguien utilizó ovocitos (células germinales femeninas en la etapa temprana de la primera meiosis y las células precursoras que producen los óvulos) para explorar el mecanismo de reprogramación de los óvulos (en mitad de la segunda meiosis). Muchos núcleos de células somáticas de mamíferos trasplantados a la vesícula germinal de ovocitos se reprogramaron directamente para expresar genes marcadores de células madre, incluidos Oct4, Nanog y Sox2 (Fig. 1B). La reprogramación nuclear dentro del ovocito no produce nuevas células, pero a diferencia del óvulo, el proceso no requiere división celular ni síntesis de proteínas. Los mecanismos que acompañan a esta reprogramación incluyen: apertura de heterocromosomas (Figura 3); marcadores de diferenciación, como la eliminación de la metilación del ADN y los intercambios de histonas, etc. Estos mecanismos ocurren en base a que los óvulos fertilizados poseen altas concentraciones de proteínas específicas que causan estos efectos. Si las proteínas del óvulo pueden intercambiarse con el núcleo de la célula somática trasplantada en cuestión de segundos o minutos, siempre debería producirse una reprogramación completa.

Sin embargo, este concepto va en contra del hecho de que los óvulos a menudo no logran reprogramar completamente los núcleos de células somáticas en los que se implantan. Si el rápido intercambio de proteínas cromosómicas descrito anteriormente se aplica a la reprogramación del núcleo del óvulo fertilizado en el óvulo, las células de rana tardarían algún tiempo, y aún más tiempo para las células de mamíferos, después de que el óvulo se divide por primera vez. una reprogramación completa.

Pero esto normalmente no sucede. Una posible razón es que los núcleos de las células trasplantadas contienen la memoria epigenética de la célula donada. Por ejemplo, después de que los núcleos extraídos de las células musculares se utilicen para la reprogramación, los nervios u otras células no musculares desarrolladas en los embriones reprogramados seguirán expresando fuertemente genes relacionados con los músculos. Esto puede deberse a la integración de la isoforma H3.3, que abunda en las histonas del óvulo, en el núcleo de la célula donante después de la transferencia nuclear. Se cree que la expresión de la histona H3.3 previene la reprogramación y preserva la memoria de la expresión genética anterior. Desde la perspectiva del desarrollo tecnológico, es posible fusionar dos células mientras se utilizan inhibidores de la división celular para garantizar que los dos núcleos se separen después de la fusión (Figura 1C). En estas fusiones, la célula dominante suele ser la que es más grande y más activa a la hora de dividirse, y también afecta a la expresión génica del otro núcleo celular. Los ejemplos incluyen la fusión de glóbulos rojos y células proliferativas cultivadas in vitro, y la fusión de células hepáticas humanas y células multinucleadas musculares. Si el citoplasma de una célula somática sin núcleo se fusiona con el de otra célula, también impondrá el perfil de expresión de la célula donante al núcleo de la célula receptora. Sin embargo, debido a que estas células fusionadas no crecieron bien, tenían poca importancia médica.

Podemos sacar algunas conclusiones importantes de estos experimentos. Primero, el agrandamiento nuclear y la descromatización cromosómica ocurren antes de la reprogramación de los perfiles de expresión genética (Figura 3). En segundo lugar, el nuevo perfil de expresión genética no depende del retroceso del perfil de expresión genética del donante ni de la división celular. Por tanto, nada de lo anterior es necesario para la reprogramación. Otra conclusión importante es que las células diferenciadas y las células embrionarias contienen moléculas reguladoras que pueden alterar la expresión de genes nucleares en otras células. Cuando la célula receptora es muy grande, como un óvulo o un haz de músculos (una célula grande compuesta por 100 o más células musculares), sus propias moléculas reguladoras superan en gran medida a los factores reguladores extraños que pueden hacer que la célula produzca las características de una célula receptora. célula madre embrionaria se vuelve comprensible (Figura 4). La función de estas moléculas en condiciones fisiológicas normales puede ser garantizar que estas células y su progenie no escapen de la línea germinal a la que pertenecen ni cambien de tipo celular. En otras palabras, las células parecen reprogramarse constantemente para garantizar que ellas y sus descendientes permanezcan dentro del linaje original. Un avance sorprendente en este campo se produjo en 2006, cuando Takahashi y Yamanaka descubrieron que después de transferir cuatro genes (Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4) a fibroblastos adultos de ratón, se podía inducir que estas células se convirtieran en células madre embrionarias con características características. . Más tarde, después de que se introdujo el sistema de detección de expresión Nanog, las células madre resultantes también mostraron la capacidad de participar en el desarrollo cuando se trasplantaron a embriones receptores con tolerancia inmune. Por tanto, se puede comprobar que son pluripotentes, por lo que se denominan células madre pluripotentes inducidas o células iPS. La obtención de células madre pluripotentes a partir de células somáticas humanas también requiere los cuatro factores de transcripción anteriores u otro conjunto de genes de reprogramación que consta de Oct4, Sox2, Nanog y Lin28. Estos procedimientos ahora están confirmados y desarrollados. Los experimentos han confirmado que las células iPS se pueden obtener a partir de células gástricas y pancreáticas terminalmente diferenciadas, y también se pueden obtener cuando se elimina el oncogén c-Myc. Estas células madre no parecen ser muy diferentes de las células madre embrionarias y eventualmente harán posible cultivar células específicas del paciente para terapia celular, proporcionar una fuente adecuada de células que puedan diferenciarse en varios tejidos o usarse para probar potenciales Medicamentos terapéuticos. Sin embargo, esto sólo se hará realidad después de utilizar métodos mejorados para eliminar los peligros ocultos de la inserción del genoma causado por vectores virales. Resultados recientes han demostrado que la inserción estable del genoma no es esencial y los estudios han informado que se pueden utilizar adenovirus o plásmidos para administrar genes extraños, lo que significa que estamos un paso más cerca del éxito.

El mecanismo por el cual las células somáticas diferenciadas se convierten en células iPS mediante la introducción de factores exógenos aún no está claro.

Debido a que en los primeros experimentos, la proporción de estas células que aparecían era muy baja (1\10000~1\1000 de las células iniciales), y las células infectadas generalmente necesitan proliferar en presencia de factores exógenos durante casi dos semanas, el origen de estas Las células iPS aparentemente accidentales son realmente difíciles de analizar. En algunos casos, el mantenimiento del estado pluripotente puede requerir la inhibición del programa de diferenciación, y los mecanismos que pueden estar involucrados se han revisado en otra parte. Cambiar el tipo de diferenciación de las células mediante la expresión exógena de genes se propuso hace muchos años después de que Weintraub descubriera el "gen maestro" MyoD. La sobreexpresión de este factor de transcripción, que se expresa específicamente en las células musculares, es suficiente para convertir una serie de células no musculares en células musculares. Sin embargo, en otros tipos de células no musculares, esta transición es sólo temporal o no se observa en absoluto. Se requiere selección para la expresión exógena de MyoD durante varias generaciones de células antes de que se observe la aparición de células similares a los músculos. Una vez convertida en células musculares, MyoD activa su propia expresión continua y ya no es necesaria la sobreexpresión de MyoD exógena.

El cambio de tipo celular entre varios otros tipos de células, especialmente entre líneas celulares formadoras de sangre, también se puede lograr mediante la expresión exógena de algunos factores de transcripción. El equilibrio mutuo de estos factores de transcripción puede activar o inhibir la expresión de genes que determinan el destino celular. Entre estos cambios (Fig. 5C) puede implicar una regresión a un estado menos diferenciado, un proceso de desdiferenciación, antes de que se formen nuevos tipos de células. En el caso de MyoD, las células cultivadas pasan por muchas selecciones de división celular para eventualmente formar nuevos tipos de células.

Uno de los últimos avances en este campo es la conversión directa de células exocrinas pancreáticas en células beta endocrinas (Figura 5D). En este estudio, 20 células exocrinas transfectadas con éxito se transformaron en células β productoras de insulina mediante el uso de adenovirus para transferir tres factores de transcripción normalmente necesarios para la diferenciación de las células β pancreáticas: Pdx1, Ngn3 y MafA. Los adenovirus que portan genes extraños no tienen que integrarse en el genoma de las células exocrinas y la necesidad de expresión de genes extraños es temporal. Además, esta conversión de linaje no requiere división celular. Esta conversión de líneas celulares, como la iPS creada por primera vez por Yamanaka, proporciona una estrategia completamente diferente para cambiar el destino celular, que consiste en intentar encontrar una serie de factores de transcripción para lograr la conversión entre tipos de células. Dos características básicas de la diferenciación celular influyen en nuestra comprensión de la reprogramación nuclear. Una es que cada tipo de célula parece expresar algunos genes que determinan su estado de diferenciación. Esta característica es especialmente obvia en los experimentos de fusión celular. Por lo tanto, las células musculares mantienen su propio estado autoactivando altos niveles de genes como MyoD. Así, cuanto más grande sea la célula, o más se parezca a una célula madre embrionaria, más moléculas de "autoreprogramación" tendrá. Por lo tanto, los óvulos pueden reprogramarse fácilmente sin la adición de factores exógenos.

La segunda característica básica de todos los experimentos de reprogramación es que cuanto más diferenciadas se vuelven las células, más difícil resulta remodelar el perfil de expresión a través de genes exógenos. A medida que las células comienzan su camino de diferenciación terminal, el estado celular diferenciado se afianza cada vez más y bloquea otras vías de diferenciación inapropiadas. Dominar esta teoría se ha convertido en un gran desafío en este campo de investigación y se ha llevado a cabo una gran cantidad de trabajo de informatización a nivel de ADN e histonas. Una hipótesis común es la estrategia de "escape rápido". Proponemos que en las regiones reguladoras de genes transcritos de forma inactiva, la unión entre el ADN y las histonas se vuelve cada vez más estrecha. Si bien la mayoría de las proteínas se disocian de su ADN unido cada pocos segundos o minutos, y en algunos casos incluso más, un complejo proteico multicomponente puede disociarse en unos pocos segundos o incluso en unos pocos minutos. Tiene un tiempo de residencia prolongado en el ADN. Por lo tanto, todos los componentes de un complejo proteico son suficientes para disociar el ADN y dejar una posibilidad muy pequeña para que los factores de reprogramación se unan. En las células madre embrionarias, la mayoría de los genes (que son genes activos en células diferenciadas) se encuentran en un estado descondensado, lo que permite que los complejos proteicos grandes tengan un tiempo de residencia más corto.

Según esta hipótesis, la probabilidad de reprogramación, ya sea lograda mediante transferencia nuclear, fusión celular, iPS o transdiferenciación, depende de la accesibilidad estadística de la región reguladora del ADN, el tiempo de acción, la concentración del transcrito y otros factores regulatorios. Las células que son grandes y poseen grandes cantidades de factores reguladores, como los óvulos y los tubos musculares, son tan susceptibles a la reprogramación como otras células cuyas concentraciones de factores de transcripción se mejoran experimentalmente. En el futuro, un avance importante será comprender por qué los núcleos de las células diferenciadas son más difíciles de reprogramar que los núcleos de las células embrionarias. Esto puede implicar una explicación de la descondensación de histonas.