¿Qué hay que analizar para detectar la apoptosis celular mediante el método hochest33258?
Método de tinción Hoechst-PI para detectar la apoptosis celular
Aunque el método del pico "G1" es simple, solo puede representar células que experimentan apoptosis en la fase G0/G1, y la fase S La apoptosis de las células en la fase G2 ocurre después del pico G1 y no se puede observar. Además, dado que todas las células están fijas, es imposible diferenciar entre células vivas y muertas, lo que puede compensarse mediante la tinción de Hoechst-PI. Las células vivas absorben Hoechst 33258, se unen al ADN y emiten fluorescencia azul bajo luz ultravioleta. Luego, el IP tiñe las células muertas con fluorescencia roja. Por lo tanto, en el histograma celular bidimensional, se pueden distinguir tres tipos de células según la fluorescencia roja y azul: las células vivas normales tienen una reacción de rechazo al tinte y tienen menos fluorescencia azul y las células apoptóticas rojas tienen un cambio en la permeabilidad de la membrana; y absorbe principalmente el tinte Hoechst, lo que muestra que la fluorescencia azul es fuerte y la fluorescencia roja es débil. Las células necróticas tienen una fuerte tinción de PI y pueden cubrir la tinción de Hoechst, por lo que la fluorescencia azul es débil y la fluorescencia roja es fuerte.
Materiales y reactivos
(1) Solución de almacenamiento de yoduro de propidio (PI): 100 mg/ml, conservar en la oscuridad a 4°C.
(2) Solución de almacenamiento Hoechst 33258: 100 mg/ml, almacenado a 4°C en la oscuridad.
(3) 0,01 mol/l de PBS, pH 7,0 ~ 7,2
Pasos de la operación
(1) Preparación de rutina de una suspensión de células individuales;
(2) Añadir solución Hoechst 33258 hasta una concentración final de 1 mg/ml y disolver en agua a 37°C durante 7 minutos;
(3) Enfriar, centrifugar, desechar la solución de tinción, y resuspender en PBS;
(4) Añadir la solución de tinción de PI con una concentración final de 5 mg/ml y mantener en un baño de hielo.
(5) Centrifugar y desechar la solución de tinción; , lave una vez con PBS y luego use un citómetro de flujo. Analice las células y use la detección directa con láser para registrar la fluorescencia azul a 400-500 nm y la fluorescencia roja por encima de 630 nm.
Resultados
Las células de control normales mostraron una fluorescencia azul débil y las células de control normales mostraron una fluorescencia azul débil y una fluorescencia roja por encima de 630 nm. p>Las células de control normales muestran fluorescencia azul débil y roja débil; las células apoptóticas muestran fluorescencia azul y roja débil, y las células necróticas muestran fluorescencia roja fuerte y azul débil.